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Targetedhigh-throughputsequencingtechniqueforthemoleculardiagnosisofprimaryimmunodeficiencydisorders
HTS技术在原发性免疫缺陷病分子诊断中的应用
杂志：Medicine
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研究背景
原发性免疫缺陷疾病(Primaryimmunodeficiencydiseases,PIDs)是一类由免疫分子遗传缺陷引起的异质性疾病，临床表现多样，相关基因众多，难以诊断。近年来，诊断PID患者分子缺陷的主要方法是PCR-Sanger测序，但费时、低效、昂贵，难以满足临床需求。本文展示了靶向高通量测序（HTS）技术对大部分PID相关基因的外显子及其侧向内含子进行测序，能够同时检测这些基因的突变。该方法灵敏度高，成本效益好，可以实现PID的快速、准确诊断。·
研究方法
研究对象：来自医院、医院等在内的12所医院的儿科、呼吸内科和血液科的56例临床患者(男性37名，女性19名，中位年龄2岁)，以及他们的生物学家属。
测序策略：
DNA提取：FlexiGeneDNA试剂盒(#、试剂盒、德国)
测序仪器：NEXTSEQ(Illumina)Q30，覆盖率达99.9%
生物信息学分析软件：RTA(real-timeAnalysis,Illumina)、BWA、GenomeAnalysisToolkit(GATK)
生物信息学分析工具和数据库：PolyPhen2、HumanSplicingFinder、SIFT、MutationTaster、NetGenes、ANNOVAR、HGMD、dbSNP、个基因组
生物学家系验证：采用PCR-Sanger测序方法
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研究结果
1.使用HTS技术在56例临床诊断的PID患者中检测个PID相关基因的突变。
2.经研究发现同一组患者中，有许多基因变异被同时检测到，而同一基因的变异也同时在几组患者中被检测到，表明基因型与表型之间存在着复杂的关系。例如，3例诊断为慢性肉芽肿性疾病患者的CYBB基因突变情况。（表1）
3.有13例(23.2%)符合PID分子诊断标准，其中8例X连锁遗传基因突变的男性是从携带者母亲那里遗传的，5例常染色体隐性遗传的男性是从携带者的父母那里遗传的。（图1和图2）
图1
图2
4.有27例患者存在两个或多个基因可能与PID有关的杂合变异，所有变异均经PCR-Sanger测序证实。16例PID患者有临床意义未明的变异。HTS测序只包括了大部分的重要PID相关基因，其在这些患者中的意义是有争议的。如何解释基因变异的意义，对于更多接受基因检测的患者，是临床医生面临的挑战。（图3）
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结论
HTS是一种准确、敏感和有成本效益的诊断工具，可以同时检测大量突变，并且常常提供精确的分子诊断。对于有不典型表现的病人来说，该方法还提供了大量具有临床意义未明的突变。这些变异是否会导致这种疾病，还需要更多的功能性证据。
参考文献：
ZuoHuaChi,WeiWei,DingFangBu,HuanHuanLi.etal.Targetedhigh-throughputsequencingtechniqueforthemoleculardiagnosisofprimaryimmunodeficiencydisorders[J].Medicine.,97(40).
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