系统性硬化症(systemicsclerosis，SSc)是一种罕见的自身免疫病，特征性的表现为皮肤和内脏器官的纤维化以及微血管病变。目前，有研究发现遗传易感性、环境因素（病毒感染、药物、化学物质如硅等）、女性激素、细胞及体液免疫异常等因素在SSc发生发展中起重要作用。但其具体发病机制仍不明确，导致缺乏有效治疗方法。
之前的研究表明SSc中多种类型的T细胞，包括Th2，Th17，Th1，Th22CD8+T细胞都能够参与致病过程。然而，在SSc病变中T细胞亚群定量以及浸润性T细胞的表型和T细胞在发病机制中的确切作用仍然缺乏信息。
发表文章来自美国哈佛大学ShivPillai团队在知名期刊Journalofclinicalinvestigation（IF=14.）发表文章，文中大量使用组织流式定量分析方法检测一系列浸润细胞。发现表达颗粒酶的CD8+T细胞和CD4+细胞毒性T细胞是SSc病变中最显著的T细胞,其通过靶向杀伤内皮细胞以及分泌IL1β等促炎因子导致组织重塑的过度活跃，从而引发血管病变和组织纤维化。
实验部分01首先，作者对35位系统性硬化症患者的皮肤进行CD3+T细胞和CD19+B细胞免疫荧光染色，通过TissueGnostic公司的TissueFAXS扫描系统对其进行拍摄，利用TissueQuest分析系统定量浸润T细胞与B细胞的百分比，发现T细胞的浸润要高于B细胞，之后作者将目光对准T细胞，利用TissueQuest分析系统对比每一位患者中CD4+与CD8+T细胞的比例。
02然后，对35名未经治疗的患者的皮肤中的CD4+T细胞亚群进行分析，包括细胞毒性T细胞CTL（CD4,GZMA,DAPI）,Th2细胞(CD4,GATA3,DAPI)和其他类T细胞。利用TissueQuest分析系统准确计算35位患者和对照组中上述三种T细胞亚群占T细胞的比例和细胞数量，得出大部分系统性硬化症患者中CD4+细胞毒性T细胞占比较高。
03为了探讨CD4+细胞毒性T细胞靶向作用的可能性，作者检测患者组织中的的凋亡信号（cCasp-3,DapI），再次利用TissueQuest分析系统对35位患者和10位正常人皮肤组织中cCasp-3阳性比例进行对比，同时获得凋亡细胞的数量，得出无论是在比例上还是数量上，系统性硬化症患者中的凋亡都要强于正常人。
04进一步的研究表明，系统性硬化症患者中的凋亡主要来源于内皮细胞。在这一结果的证明中，作者使用多色染色标记分析CD4+细胞毒性T细胞（CD4,GZMA,cCasp-3）与内皮细胞（CD31）空间位置关系，发现浸润性CD4+CTL常常分布在内皮细胞周围,其中一些内皮细胞正在发生凋亡，胞浆中可见GZMA，这表明内皮细胞可能代表CD4+CTL定向的细胞毒性靶点。
文章的最后对CD4+CTL进行了转录组的分析，从转录水平上分析与细胞毒性、代谢活性和组织重塑相关的基因的变化，并使用CTLA-Ig(能过阻断T细胞活化)治疗患者，4例患者中有3例组织浸润的CD4+CTL明显下降，得出持续的T细胞活化似乎是早期弥漫性SSc的一个特征。
因此，针对CD4+CTL可能是治疗这类疾病的重要靶点。这篇文章使用了大量的免疫荧光染色及利用TissueQuest分析系统实现数据的准确定量分析，为文章的数据获得提供了强有力的支持!
TissueCytometry技术对免疫细胞的多表型准确定量分析方面，在对组织样本多色标记的基础上，对每一个细胞进行识别，并分别对其每一个荧光染色通道进行亚细胞结构的形态学分析。准确的判断任意蛋白共表达的细胞阳性率的情况，更可以在组织原位判断其相对的位置分布关系。这种针对细胞功能的深度挖掘分析，为组织原位的免疫研究提供了更广阔更深入的技术手段，已经成为了当前研究者们的常用研究方法之一。
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