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免疫缺陷小鼠的人源化免疫重建

供稿人:吴成伟

整理编辑:谢许茵

摘要:

由于啮齿动物有短再生周期和相对容易产生近交系突变或转基因系的特点,已被广泛用于研究移植免疫学。虽然啮齿动物和人的大部分生物学机制是相似的,但是免疫系统有鲜明的种属特点,因此,啮齿动物的研究观察很难像临床转化。体外研究人体细胞在阐明基础机制上非常有用,但是,体内研究也是必不可少的。在随后的几年里,大量的免疫缺陷鼠重构人源细胞的动物模型被报道,这些动物被称为人源化小鼠动物模型,用于在活体内研究人类的免疫反应。这开启了一个新的领域,称为实验免疫学。实验免疫学已经被广泛的应用于癌症、自身免疫、过敏、感染和转移生物学领域的研究。这篇综述着重讲解免疫缺陷小鼠和免疫缺陷小鼠人源化免疫重建的历史现状。

前言:

通过将人源免疫细胞或造血细胞移植进入免疫缺陷小鼠体内可以在小鼠上构建人源免疫系统,称为人源化免疫小鼠。为了避免人源细胞被小鼠排斥,必须在免疫缺陷小鼠上进行人源免疫细胞重建。重构的人源免疫系统小鼠可以用于研究人类免疫细胞在活体内的反应,首次报道成功将人源细胞移植进入严重免疫缺陷小鼠体内以来,这个方法已经被广泛的应用于肿瘤、自身免疫、过敏和移植生物学的研究。

免疫缺陷小鼠

第一个免疫缺陷鼠模型是无胸腺裸鼠,一个突变小鼠品系,除了缺少胸腺同时也缺少毛发。这种小鼠拥有B细胞和NK细胞,但是缺少T细胞,无法产生T细胞抗体。一系列的人类肿瘤细胞可以被成功的移植到裸鼠身上,但是正常的人类细胞会被裸鼠排斥。X连锁的免疫缺陷小鼠缺乏B细胞型号传导所必须的X连锁基因,与无胸腺裸鼠进行杂交可以获得T细胞与B细胞双重缺失的小鼠模型。随后,出现了重度免疫缺陷(SCID)小鼠,由于负责DNA修复的基因产生了突变,T细胞和B细胞受体生产必须的重组可变多样性连接片段过程被严重抑制,然而这种老鼠的依然有固有免疫系统功能,比如NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞。基因修复缺陷不仅仅影响了小鼠的免疫系统,同时这种小鼠品系相对辐射敏感。这种小鼠品系的另一个缺点是重组可变多样性连接片段过程的抑制效果并不完全,有一定量的小鼠会发生免疫泄露,拥有正常的免疫系统功能。免疫泄露的发生随着年龄的增加。为了消除免疫缺陷小鼠上的固有免疫系统,免疫缺陷小鼠与基因突变小鼠“beigemice”进行杂交。Beige基因突变造成了溶酶体运输的缺陷。SCID/beige小鼠不仅拥有T细胞和B细胞的缺陷同时NK细胞的功能和吞噬作用也严重缺陷,免疫泄露的频率比单纯的免疫缺陷小鼠低,同时不会随着年龄的增加而增加。

消除免疫缺陷小鼠固有免疫系统的另外一个方式是将免疫缺陷小鼠与非肥胖糖尿病(NOD)小鼠进行杂交。NOD小鼠有严重的免疫异常现象,这种免疫异常是小鼠糖尿病易感表现的构成因素。小鼠有特殊的主要组织相容性复合物(MHC)表型促进糖尿病的发展。NOD/SCID小鼠并没有出现糖尿病,但是有胸腺瘤高发。通过与不同的基因敲除小鼠进行杂交,这个模型被进一步的发展。NOD/SCID/β2Mnull小鼠是第一种NOD/SCID小鼠与基因敲除小鼠的杂交品系,这种小鼠品系中缺乏微球蛋白β2(β2M)阻止了MHCI类分子的表达。缺少MHCI类分子造成了CD8+Tαβ的完全缺失,相比于NOD/SCID小鼠拥有更高效的免疫缺陷。血色沉着病(HFE)基因是与铁转运相关的非经典的MHCI类分子基因,由于无法表达这一基因小鼠会发生血色沉着病寿命减短。在NOD/SCID/γnull小鼠品系中,属于白介素2受体的γ基因失效,γ链同时在白介素2、7、9、15中被使用,这种品系的小鼠拥有高度的免疫缺陷,敲除的基因为X连锁。Rag-1基因和T细胞、B细胞受体必要的的可变多样连接片段重组相关,相比于SCID小鼠,Rag-1缺陷小鼠不会发生免疫渗漏。然而,重构的NOD/Rag1null小鼠拥有NK细胞活性。同时敲除穿孔素基因,小鼠失去NK细胞的细胞毒性功能。

最常使用的免疫缺陷鼠品系

人外周血单个核细胞免疫重建与副作用

年,第一个人源化免疫细胞SCID小鼠被报道。在小鼠腹腔中注射10-90百万外周血单个核细胞(PBMC),在小鼠外周血中可以检测到人类T细胞和B细胞存在,人类巨噬细胞在小鼠的淋巴组织中被发现。显而易见,T细胞和B细胞是拥有功能的,对重组后20周内的小鼠接种破伤风类毒素,小鼠体内产生了特异性的抗体反应和体外的T细胞增殖反应。静脉注射PBMC没有成功构建人源免疫系统。在静脉注射人源免疫细胞后,小鼠产生迅速的排斥反应,在肺组织中捕获消除人源免疫细胞。在随后的几年,大量的研究表明使用SCID小鼠模型通过PBMC进行免疫重建具有局限性。重构的免疫系统多变,可能是由于SCID小鼠固有的免疫系统。当小鼠被NK细胞、巨噬细胞、粒细胞抗体处理后,人源PBMC的摄取得到增强。虽然,T细胞免疫系统容易构建,但是B细胞和抗原呈递细胞(APC)的移植效果一般较差。但使用人类脾细胞进行免疫重建,B细胞和APC细胞的构建得到提升,尤其在小鼠进行过低剂量(2Gy)的辐照处理后。所有这些模型的一个普遍问题是移植物抗宿主病的发展(GVHD)。由于小鼠固有免疫系统和人类免疫细胞组分之间的相互作用,这种情况在SCID小鼠模型中尤其明显。低剂量的人源PBMC细胞注射在几周后会被小鼠清除,高剂量的注射会照成小鼠脾肿大,由于人源T细胞和B细胞的定植以及小鼠造血细胞的扩增。人源化小鼠的移植物抗宿主是非典型的,从来没有急剧发生,皮肤和肠道系统症状没有被注意到过。所有的人源化免疫小鼠中都观察到了移植物抗宿主病,但是表型多变,有些小鼠在免疫重建3-4周后死于竭耗综合征,然而,有些小鼠可以没有症状存活几个月。

辐照与NSG小鼠人源PBMC免疫重建

比较NSG小鼠辐照和非辐照处理后,人源PBMC免疫重建效果。辐照NSG小鼠与非辐照NSG小鼠人源免疫重建分别对应9周和4周实验需求。在9周实验方案中,NSG小鼠接受cGy的亚致死量辐照,24小时后注射人源PBMC。相对于9周实验方案,4周实验方案的非辐照NSG小鼠直接注射人源PBMC进行人源化免疫重建。每周取9周和4周实验方案的NSG小鼠血液进行CD3/CD45阳性细胞流式技术分析,在第三周时,4周实验方案小鼠相对于9周实验方案小鼠有更快的免疫重建效率,4周实验方案NSG小鼠中CD62L-阳性细胞比例较高。两种实验方案NSG小鼠在第四周有类似的免疫重建效果。

PBMC注射方式与NSG小鼠人源免疫重建

这一部分主要讲解NSG小鼠人源PBMC免疫重建时的移植动力学、最优化PBMC数量、不同注射路径对NSG小鼠免疫重建的影响。即使PBMC的注射剂量非常低,NSG小鼠在3-4周内也会拥有较高水平的人源PBMC移植效果。NSG小鼠是人类淋巴造血细胞移植研究的金标准。腹腔注射和静脉注射人源PBMC进行免疫重建是经常报道的两种方式,以NOD/SCID小鼠作为对照,探讨NSG小鼠的PBMC人源化免疫重建效果。腹腔注射人源PBMC对NOD/SCID小鼠进行人源化免疫重建时常被报道,然而,很少有静脉注射人源PBMC细胞对NOD/SCID小鼠进行免疫重建的报道。腹腔注射20*人源PBMC细胞后,人源CD45+细胞在NSG小鼠血液中的水平显著高于NOD/SCID小鼠。同时,人源CD45+细胞在脾脏中的比例也是NSG小鼠显著高于NOD/SCID小鼠。

最优的人源PBMC注射途径

比较静脉、腹腔和脾脏三种不同的注射途径,阐述最优的人源PBMC注射途径。在进行静脉注射后的第4周,人源CD45+细胞在小鼠外周血中显著高于腹腔或脾脏注射途径。同时,静脉注射途径NSG小鼠脾脏中的人源PBMC免疫创建效率显著高于NOD/SCID小鼠。在免疫重建4周后,腹腔、静脉、脾脏三种注射途径的NSG小鼠脾脏中人源CD45+细胞移植重建水平相似。静脉注射人源PBMC构建NSG小鼠免疫系统相对于腹腔和脾脏注射拥有更好的重建效率。在NSG小鼠静脉中注射20*的人源PBMC细胞,评估NSG小鼠免疫重建动力学表型。在免疫重建后的4周中,每周进行外周血和脾脏中人源CD45+细胞评估。在免疫重建的前3周,人源细胞在NSG小鼠血液和脾脏中逐渐增加,在第4周,脾脏相比血液有更高水平的人源细胞移植。在人源PBMC注射后的第3周,人源CD45+细胞在脾脏中的数量也达到了平台。在血液和脾脏中主要的人源PBMC移植细胞为CD3+细胞,CD4:CD8比例大约在1:1。在注射20*人源PBMC细胞后,检测NSG小鼠血液中IgM和IgG水平。免疫重建后的NSG小鼠血液中存在较高的IgM和IgG水平,表明激活的人B细胞移植成功或者幼稚B细胞异种激活成功。

NSG小鼠人源PBMC免疫重建细胞剂量依赖性

NOD/SCID小鼠进行免疫重建需要腹腔注射50-*人源PBMC细胞。有些实验研究中,PBMC来源于儿童,这对于试验研究是一个重要的限制,由于没有足够的细胞。人源PBMC细胞进行免疫重建最常使用的是腹腔注射途径,所以首先阐述NSG小鼠腹腔注射人源PBMC后免疫创建效率。在NSG小鼠中,腹腔注射20*或50*人源PBMC后,人源CD45+细胞在移植后第4周水平相近,相比于20*更高剂量的50*人源PBMC没有造成更高水平的免疫重建效果。在静脉注射途径中,1-10*的PBMC剂量范围内,随着细胞数量的增加,NSG小鼠获得更高水平的人源免疫重建效率,当达到10*后,静脉注射免疫重建效率达到平台期。相对于腹腔注射,静脉注射需要的PBMC数量相对较少且具有更好的重建水平。

PBMC供体对免疫重建的影响

在免疫缺陷小鼠中,供体自身和供体之间的PBMC移植效果多样性一直是PBMC免疫重建中的主要缺陷。这里将阐述NSG小鼠PBMC免疫重建效果的差异性。NSG小鼠接种同一供体来源的PBMC或者不同供体来源的PBMC细胞,静脉注射进行免疫重建后,评估人源CD45+细胞在血液和脾脏中的百分比以及数量。人源PBMC免疫重建后的NSG小鼠外周血人源CD45+细胞水平差异较大,脾脏中人源CD45+细胞定植无明差异。

总结

NSG小鼠相较与其他种类免疫缺陷小鼠更适合用于人源淋巴造血干细胞移植与研究,静脉注射10*人源PBMC细胞为最佳途径,免疫重建后的人源CD45+细胞中主要为CD3+细胞,B细胞和APC细胞较少,脾细胞移植和辐照后移植能促进B细胞与APC细胞的定植重建,人源PBMC免疫重建平台期在3-4周,适合于短期实验研究。

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