研究背景
半胱氨酸蛋白酶caspase家族成员在控制宿主细胞死亡、先天性免疫应答和内环境平衡中发挥至关重要的作用。目前为止，在哺乳动物中被鉴定出的caspases有14种，根据他们的功能，可以分为炎症性caspases（caspase-1、-4、-5和-11）和凋亡性caspase（caspase-3、-6、-7、-8、-9和-10）。凋亡性caspases进一步功能性划分为启动凋亡caspase（caspase-8、-9和-10）和效应（或执行）caspase（caspase-3、-6和-7）。caspases参与了机体应对损伤相关或病原体相关分子模式（DAMPs或PAMPs）的多种细胞死亡途径。其中一种细胞死亡途径，即细胞焦亡（细胞炎症性坏死），在炎症小体组装后，由依赖caspase-1剪切的gasderminD（GSDMD）执行。细胞焦亡促使炎症小体依赖性的细胞因子白介素IL-1β和IL-18有效释放。这种细胞死亡途径可以导致炎症，但是凋亡caspase激活的细胞凋亡是一个非炎症过程。应对细胞凋亡信号时，启动caspases近距离感应并自我激活，随后加工处理效应caspases以发挥凋亡功能。
研究表明，凋亡性caspases和炎症性caspases之间的相互作用能够调节炎症小体的活化以及细胞凋亡和焦亡。在没有caspase-1的情况下，炎症小体NLR1b、NLRC4和AIM2能够招募caspase-8诱导细胞凋亡，这提示凋亡性caspases在炎症小体激活中的代偿作用。炎症性caspase-1还可以在细胞缺乏GSDMD时通过Bid-caspase-9-caspase-3轴引发细胞凋亡。除此之外，凋亡性caspase还能够调节细胞焦亡。在耶尔森氏鼠疫杆菌（Yersinia）感染时Caspase-8可以剪切GSDMD,引起细胞焦亡。caspase-3和-7均能够通过剪切GSDMD的氨基末端结构使其失活，提示细胞凋亡对细胞焦亡的抵消作用。然而，效应因子caspase-6在调节程序性细胞死亡和炎症小体活化的作用仍旧不明确。
为了了解caspase-6在免疫损伤过程中的生物学作用，本文研究了多种DAMPs和PAMPs刺激后或应对不同感染时，caspase-6缺乏对炎症小体激活的影响。研究表明在甲型流感病毒（IVA）感染过程中，caspase-6在先天性免疫、Z-DNA结合蛋白（ZBP-1）介导的炎症小体活性、细胞死亡和宿主防御中发挥重要作用。IAV感染后Caspase-6能够与受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）结合并增强ZBP1与RIPK3的相互作用，促进ZBP1介导的细胞焦亡、凋亡和坏死（PANoptosis），参与宿主防御感染，是先天性免疫和ZBP1-NLRP3炎症激活所必需的。
研究结果
1、Caspase-6促进ZBP1介导的NLRP3炎症小体激活
NLRP3炎症小体可以通过感染和内源性配体（如ATP和尿酸晶体）以经典方式被激活，也可以通过caspase-11或人类对应的caspase-4/5感应脂多糖（LPS）以非经典方式被激活。启动caspase-8在NLRP3的经典和非经典激活方式中均发挥至关重要的作用。此外，研究表明效应caspase-3/7也在NLRP3炎症小体激活通路上游发挥作用。
为了研究caspase-6是否与NLRP3炎症小体激活有关，用ATP或尼日利亚菌素（nigericin）处理LPS诱导的野生型（WT）和caspase-6缺陷型（Casp6–/–）骨髓源性巨噬细胞（BMDMs），发现两种基因型的BMDMs都显示了相似的caspase-1裂解、炎症小体效应细胞因子IL-1β和IL-18生成以及细胞焦亡，这表明caspase-6对经典的NLRP3激活是非必需的（图1A-1D）。此外，caspase-6对LPS转染引起的NLRP3非经典炎症激活也是非必要的（图1E-1H）。
已有研究证明NLRP3炎症小体也可以在ZBP1感应到IAV感染时被激活。为了研究caspase-6在ZBP1介导的NLRP3活化中的作用，用IAV感染WT和Casp6-/-BMDMs，发现与WTBMDMs相比，IAV感染后Casp6-/-BMDMs中caspase-1裂解和IL-1β和IL-18的产生显著降低，细胞死亡减少（图1I-1L），这表明caspase-6促进了ZBP1介导的NLRP3炎症小体活化。
接下来，作者用铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）和鼠伤寒沙门氏菌（S.Typhimurium）感染WT和Casp6-/-BMDMs，发现两种细胞中caspase-1的激活、IL-1β和IL-18的产生以及细胞死亡的水平相似，表明caspase-6在NLRC4炎症小体激活中没有作用（图1M-1P）。同时，用弗朗西氏菌(F.novicida)感染WT和Casp6-/-BMDMs，结果也表明caspase-6在AIM2炎症小体的激活也是非必需的（图1Q-1T）。而用难辨梭菌(C.difficile)AB+株毒素感染细胞，caspase-1裂解水平也不变，表明caspase-6对PYRIN炎症小体的活化是非必需的（图S1G，未列出）。
因此综上所述，caspase-6促进了ZBP1介导的NLRP3炎症小体活化，但对经典或非经典的NLRP3、NLRC4、AIM2和PYRIN炎症小体激活是非必需的。
Casp6-/-BMDMs中NLRP3炎性小体激活减少可能是由于IAV感染时caspase-6促进了炎性小体组分的上调。然而，在IAV感染的WT和Casp6-/-BMDMs中，NLRP3和pro-IL-1β的表达水平一样，且炎症通路活化水平相似，表明caspase-6不影响NLRP3炎症小体组分的表达（图2A）。此外，预先用Pam3CSK4（TLR1/2激动剂）处理Casp6-/-BMDM细胞也不能增加IAV感染导致的caspase-1裂解，表明caspase-6促进ZBP1介导的NLRP3炎症小体活化是不依赖于预先诱导的（图2B）。
IAV感染WT和Casp6-/-BMDMs后，Casp6-/-BMDMs中STAT1的活化和ZBP1的表达均未改变，表明caspase-6调节NLRP3的活化不依赖于IFN信号和ZBP1的表达（图2C）。Casp6-/-BMDMs中NLRP3炎症小体活化降低可能是因为IAV病毒复制减少。然而在WT和Casp6-/-BMDMs中病毒非结构蛋白NS1和结构蛋白M1的表达水平相当（图2C）。同时，Casp6-/-BMDMs中病毒的转录（M1mRNA）和复制（M1vRNA）水平并未降低（图2D）。单周期复制实验也直接证明IAV在Casp6-/-BMDMs中的复制未受影响（图2E）。
以上结果表明，IAV感染的BMDM细胞中caspase-6调节ZBP1介导的NLRP3炎症小体激活不需要NLRP3的预先启动，且不依赖于病毒的复制。
2、Caspase-6是IAV诱导的细胞焦亡、凋亡和坏死所必需的
除了调节NLRP3的活化之外，ZBP1还能调节IAV感染后的各种细胞死亡途径。IAV感染WT和Casp6-/-BMDMs后，Casp6-/-BMDM细胞死亡数减少，表明caspase-6的缺失不仅影响了ZBP1介导的NLRP3的活化，还影响了ZBP1介导的程序性细胞死亡（图3A和3B）。并且作者利用CRISPR基因编辑技术敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中的caspase-6基因，即Casp6KO（图3C）。与WTMEFs相比，Casp6KOMEFs感染IAV后细胞死亡减少（图3D和3E），进一步验证了caspase-6对ZBP1介导的细胞死亡的影响。
接下来作者研究了IAV感染后caspase-6在ZBP1介导的PANoptosis中的作用。之前的结果（图1I-1K）表明Casp6-/-BMDM中IAV引起的细胞焦亡减少，即caspase-1裂解以及IL-1β和IL-18生成减少。GSDMD的裂解减少进一步证明caspase-6促进了IAV感染后ZBP-1介导的细胞焦亡。（图3F）。同时与WTBMDMs和MEFs相比，IAV感染后Casp6–/–BMDMs和Casp6KOMEFs中启动因子caspase-8和效应因子caspase-3与-7的裂解均减少，说明caspase-6调节IAV感染后ZBP1介导的细胞凋亡。细胞坏死是RIPK3的激活与其介导的混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)的磷酸化诱导的。感染IAV后Casp6–/–BMDMs中MLKL磷酸化水平降低（图3J），表明caspase-6促进了IAV感染后ZBP-1介导的细胞坏死。
综上所述，caspase-6在IAV感染后ZBP-1介导的细胞死亡途径中发挥重要作用，促进了细胞焦亡、凋亡和坏死。
3、Caspase-6缺乏增加小鼠对IAV感染的敏感性
由于ZBP1在宿主对抗IAV感染中具有重要作用，因此作者用IAV经鼻感染小鼠，并监测小鼠体重变化和存活率，以此来研究caspase-6在宿主对抗IAV感染中的作用。在第一周WT和Casp6-/-小鼠的体重变化相似，但是在第二周，Casp6-/-小鼠的体重恢复比WT小鼠慢（图4A）。此外，感染IAV的Casp6-/-小鼠数量明显多于WT小鼠（图4B）。且用IAV感染Casp6+/–和Casp6–/–幼鼠，发现感染IAV的Casp6–/–的小鼠更多（图4C），表明caspase-6缺乏导致小鼠对IAV的敏感性增加。另外与WT小鼠相比，Casp6–/–小鼠在感染后第5天肺部的病毒NP染色显著增加，病毒传播范围更广，提示caspase-6在控制IAV在肺部的传播中起着重要作用（图4D）。
为了评估病毒在Casp6–/–小鼠中的复制情况，作者收集了受感染小鼠的肺部并测定病毒滴度，发现在感染后第3天WT和Casp6–/–小鼠的病毒载量没有显著差异（图4E），而在第7天，Casp6–/–小鼠肺部的病毒滴度显著增加（图4F）。同时，对感染后小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-1β的含量进行检测，发现在第3天，WT和Casp6–/–小鼠之间无差异（图4G），而在第7天，Casp6–/–小鼠BALF中的IL-1β水平显著降低（图4H），表明IAV感染后Casp6–/–小鼠的肺部可能存在炎症小体激活缺陷。此外，在感染后第5天Casp6–/–小鼠表现出明显的肺损伤（图4I）。同时IAV感染后Casp6–/–小鼠肺部的Arg1+交替激活巨噬细胞（AAMs）少于WT小鼠（图4J）。
综上结果表明，caspase-6参与了宿主对IAV感染的防御，caspase-6的缺失增强了小鼠对IAV的敏感性，且影响了宿主对病毒的清除。
4、Caspase-6与RIPK3结合增强RIPK3与ZBP1的相互作用
上述体内外研究结果表明caspase-6与ZBP1介导的IAV感染反应密切相关，因此作者研究了caspase-6与ZBP1及其相关蛋白的相互作用。IAV感染后，与WTBMDMs相比，Zbp1–/–BMDMs中启动因子caspase-8和效应因子caspase-3与-7的裂解、GSDMD的裂解和MLKL的磷酸化均减少，表明ZBP1是启动细胞凋亡、焦亡和坏死所必需的（图5A和5B）。另外，caspase-6的裂解也减少，说明ZBP1能够促进IAV感染时caspase-6的活化（图5A）。
ZBP1通过受体相互作用蛋白同型相互作用基序（RHIM）招募RIPK3和RIPK1，形成一个细胞死亡复合物，随后再来招募FADD和caspase-8（图5C）。研究发现，感染IAV后，与WTBMDMs相比，Ripk3–/–BMDMs中凋亡性caspase-3和-7以及坏死性MLKL的激活都被抑制（图5D和5E）。同时Ripk3–/–和Ripk3–/–Casp8–/–BMDMs中GSDMD的裂解也被阻断（图5D）。表明RIPK3在ZBP1介导的细胞凋亡、坏死和焦亡中发挥重要作用。此外，在Ripk3–/–和Ripk3–/–Casp8–/–BMDMs中caspase-6的裂解都减少，表明RIPK3可以单独促进caspase-6的活化（图5D）。caspase-6调节了ZBP1和RIPK3介导的三种细胞死亡途径，由此作者假设caspase-6可能在调节ZBP1-RIPK3细胞死亡复合物的水平上发挥作用（图5C）。
为了验证这一假设，作者在T细胞中过表达了caspase-6和ZBP1-RIPK3复合物的不同组分。WTcaspase-6的过表达会引起显著的T细胞死亡，因此caspase-6进行了催化死亡突变，得到突变体caspase-6-CA（caspase-6-CA）。免疫共沉淀结果发现caspase-6不能与ZBP1、RIPK1或caspase-8结合，而只能与RIPK3结合（图5F），表明caspase-6可能通过与RIPK3结合而被招募到细胞死亡复合物中。已有研究表明，RIPK1RH1M结构域缺失时，RIPK3与ZBP1的结合显著增强，提示RIPK3和RIPK1可能竞争性结合ZBP1。随着caspase-6的表达量增加，与RIPK3共沉淀的RIPK1的含量不变，而ZBP1的含量则随之显著增加（图5G），表明caspase-6可以增强ZBP1和RIPK3之间的相互作用。这种增强作用是通过caspase-6的催化死亡突变实现的，表明在这一过程中caspase-6起着支架作用，与其酶活性无关。WT和Casp6–/–小鼠BMDMs的内源性共免疫沉淀实验也发现，caspase-6的缺失导致与RIPK3免疫共沉淀的ZBP1的数量减少（图5H），进一步证明caspase-6增强了ZBP1和RIPK3的相互作用。
综上可知，caspase-6与RIPK3结合增强了ZBP1和RIPK3的相互作用，且此作用与caspase-6的支架作用有关，与其酶活性无关。
5、Caspase-6的大小亚基对RIPK3与ZBP1的结合都至关重要
在生理条件下，caspase-6可以裂解为大小两个亚基，即氨基末端结构域（CASP6-N）和羧基末端结构域（CASP6-C）；RIPK3是由一个氨基末端激酶结构域（RIPK3-N）和一个含RHIM的羧基末端结构域（RIPK3-C）组成（图6A）。T细胞过表达caspase-6和RIPK3的截短突变体的免疫共沉淀结果显示，caspase-6的CASP6-N和CASP6-C都能分别与RIPK3的RIPK3-N和RIPK3-C相互作用，且与全长RIPK3都有很强的结合（图6B）。而无caspase-6结构域时，RIPK3的所有结构域均未被沉淀下来，表明caspase-6结构域与RIPK3结构域之间的相互作用是特异的。此外，全长caspase-6以及N端和C端caspase-6结构域都能够促进RIPK3和ZBP1之间的相互作用（图6C）。
在缺乏共同的同型相互作用域的情况下caspase-6如何与RIPK3结合尚不清楚。通过蛋白质无序预测系统（prDOS）分析发现caspase-6和RIPK3中均含有固有无序区域（IDRs）。有研究认为，RIPK3的无序区域是其RIHM结构域介导的相互作用的关键。由于IDRs在两个蛋白的氨基和羧基末端都存在，因此这些IDRs可能介导了caspase-6和RIPK3结构域之间的相互作用。
综上所述，caspase-6能够通过推测的IDRs与RIPK3结合，促进ZBP1和RIPK3之间的相互作用。
6、Caspase-6的Caspase活性对于ZBP1介导的炎症小体活化是非必需的
由于caspase-6增强ZBP1和RIPK3的相互作用不依赖于其caspase蛋白酶活性（图5G和6C），因此作者探讨了ZBP1介导的炎症小体激活中是否需要caspase-6的酶活性。层粘连蛋白A/C（caspase-6酶活性底物）裂解实验表明，WTcaspase-6（图S6C）和caspase-6-CA（图S6D）在Casp6–/–iBMDMs中表达成功，且两者均能够增加IAV导致的caspase-1活化（图S6E和S6F），表明IAV诱导炎症小体激活不需要caspase-6的酶活性。结果进一步证明caspase-6的caspase
活性对其调节ZBP1介导的炎症小体活化是非必需的，且暗示其潜在的支架蛋白作用。
综上可知，Caspase-6的Caspase活性对于增强ZBP1与RIPK3的结合及其介导的炎症小体活化是非必需的，证明其作为支架蛋白的作用。
讨论与结论
作为一种神秘的Caspase，Caspase-6虽然被归类为一种凋亡执行caspase，并与包括阿尔茨海默病和亨廷顿病在内的几种神经系统疾病有关，但在其他生物学过程中Caspase-6的功能和作用依旧成谜。本研究确定了caspase-6在调节ZBP1介导的NLRP3炎症小体激活和程序性细胞死亡中的作用。在作用机制上，作为一种支架蛋白，caspase-6与RIPK3的结合增强了RIPK3与ZBP1在IAV感染后的相互作用。
IAV感染后RIPK3可以与RIPK1竞争性地结合ZBP1，而Caspase-6与RIPK3的结合则增强了RIPK3与ZBP1的相互作用。这为揭示RIPK1、RIPK3和ZBP1这三个含有RHIM结构域的蛋白之间的神秘关系提供了线索。本研究推测caspase-6是通过IDRs与RIPK3结合发挥作用。虽然没有直接的证据，但是已有研究证明RIPK3的IDR是其RHIM结构域介导的相互作用的关键，而RIPK3的RHIM结构域埋藏在IDRs中，但在信号激活过程中RHIM结构域的暴露过程尚不清楚。此外，Caspase-6缺失导致小鼠对IAV感染的敏感性增强，表明其在宿主对抗IAV感染中的重要作用，但是caspase-6在体内的作用机制还需要更深的研究。
综上所述，本文首次揭示了caspase-6在调控ZBP1介导的NLRP3炎症小体激活和程序性细胞死亡中的作用，且这种作用与其蛋白酶活性无关。Caspase-6对经典的NLRP3、AIM2、NLRC4和PYRIN炎症激活以及典型触发因子诱导的细胞凋亡和坏死都是非必需的。重要的是，在IAV感染的小鼠模型中，caspase-6是宿主防御所必需的。在分子水平上，caspase-6与RIPK3结合增强了RIPK3与ZBP1的相互作用，促进了对caspase-6在PANoptosis中作用机制的理解，为开发细胞死亡途径异常疾病的治疗方法提供了依据。
读者思考：ZBP1可以感应Z-RNA（由流感病毒产生的新型RNA），与RIPK3相互作用并激活其介导的细胞焦亡、凋亡与坏死，以清除被感染的细胞。在这过程中，caspase-6作为支架蛋白，可以增强ZBP1与RIPK3的相互作用，发挥促进作用。作为凋亡caspases，ZBP1和RIPK还可以促进caspase-3/6/7的活化，促进细胞凋亡。但是caspase-6的酶活性在其调节ZBP1介导的过程中的作用并不清楚？且其如何以支架蛋白的作用与RIPK3结合的具体过程还需要进一步验证。
本文于年4月15日发表于Cell杂志上，第一作者是MinZheng，通讯作者为Thirumala-DeviKanneganti，DepartmentofImmunology,St.JudeChildren’sResearchHospital,Memphis，USA
为通讯单位。原文链接：
