作者：王强杜琴郭斌
郭杨柳方莉郭晓兰
新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的诊断主要根据流行病学史、临床实验室和胸部放射学检查结果，而确诊依赖于核酸分析[1,2,3]。核酸检测对实验室条件和人员素质要求较高，且存在检测试剂盒供应不足，检测通量较低和耗时较长的缺点，同时由于多种因素导致单次咽拭子采集检测结果阴性，往往需要多次采集咽拭子或下呼吸道样本才能达到确诊的目的，因此核酸检测尚不能满足目前大规模疑似病例的检测需要[4]。
临床实验室主要通过检测血清内特异性免疫球蛋白M（immunoglobulinM，IgM）抗体来评价病原体的急性期感染[5]。通常情况下，IgM抗体最早可在感染后1周内检测到，对于病原体存在机体的组织器官没有选择性，对送检标本的质量要求不高，避免了因取样而导致的假阴性结果。目前，临床实验室常采用胶体金免疫层析法（goldimmunochromatographyassay，GICA）和酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）来快速检测特异性抗体[6,7]。采用上述两种方法进行新型冠状病毒（novelcoronavirus，-nCoV）IgM抗体检测，可以有效辅助确认或排查疑似人群及密切接触人群中的-nCoV感染者，提高流行病学监测准确性，对患者的管理及疫情防控尤为重要。然而，笔者在使用GICA和ELISA对-nCoVIgM检测过程中，偶然发现类风湿因子IgM（rheumatoidfactorIgM，RF-IgM）干扰两种方法检测结果的现象。
特异性抗原与交叉抗体的反应亲和力低于特异性反应[8]，同时尿素可作为抗原抗体反应之间的解离物质，用于评估免疫球蛋白G（immunoglobulinG，IgG）的亲和力，如不同检测体系中弓形虫IgG的亲和力评价[9]。因此推测，采用适当尿素浓度的尿素解离试验将有助于消除或降低RF-IgM对GICA和ELISA法检测-nCoVIgM结果的影响。
对象与方法
一、对象收集年1月22日至2月15日就诊医院的不同病原体感染及相关慢性疾病患者共71例。依据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》（试行第五版修正版）对于COVID-19的诊断标准，所有入组的5例A型流感病毒IgM抗体阳性患者、5例B型流感病毒IgM抗体阳性患者、5例肺炎支原体IgM抗体阳性患者、5例嗜肺军团菌IgM抗体阳性患者、6例人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）感染患者、29例IgM型类风湿因子（rheumatoidfactorIgM，RF-IgM）阳性患者、5例高血压患者和5例糖尿病患者均无COVID-19的流行病学接触史和相关的影像学及临床实验室指征，而6例COVID-19确诊患者符合诊断标准，确诊患者均在发病后3~5d内采集全血，并分离血清。除RF-IgM阳性血清外，其他患者血清的RF-IgM检测结果均低于20.00IU/ml。本研究医院伦理委员会批准实施（批件号：ER-1）。鉴于COVID-19的传染性，以及所纳入试验的生物样本检测以匿名的方式进行，医院伦理委员会同意了本研究知情同意的豁免申请。二、方法1．试剂与仪器：呼吸道8联检试剂盒购自德国欧蒙有限公司；RF-IgM检测试剂盒购自美国贝克曼库尔特公司；HIV初筛检测试剂盒购自德国罗氏公司；-nCoV核酸检测试剂盒购自上海之江生物科技股份有限公司；-nCoVIgM检测试剂盒由北京热景生物技术股份有限公司赠送。2．检测方法：A和B型流感病毒IgM抗体、肺炎支原体IgM抗体和嗜肺军团菌IgM抗体采用间接免疫荧光法检测；RF-IgM采用速率散射比浊法检测；HIV初筛采用电化学发光法检测，HIV确诊采用免疫印迹法检测（确诊信息由疾控中心检测后反馈）；-nCoV核酸采用实时荧光RT-PCR法检测；-nCoVIgM分别采用GICA法和ELISA法检测。3．GICA法尿素解离试验：向稀释液中加入μl血清标本，混匀后，吸取μl稀释标本滴入检测卡加样处，液体在毛细管效应下向上层析，待液体即将到达上部吸水纸端时，吸取μl含6mol/L尿素浓度的磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsaline，PBS）滴入检测卡加样处，并开始计时，20min后观察结果。标本中的-nCoVIgM抗体先与胶体金标记的抗人IgM抗体结合，在测试线（T）位置与包被的-nCoV重组抗原结合，形成固相-nCoV抗原--nCoVIgM抗体-胶体金标记抗人IgM抗体复合物。在质控线（C）位置形成固相羊多抗IgG-胶体金标记抗人IgM抗体复合物。阳性判断标准：T线和C线位置同时出现胶体金显色反应；阴性判断标准：仅C线位置出现胶体金显色反应。4．ELISA法尿素解离试验：将8μl血清标本加入至μl标本稀释液中，并充分混匀，吸取μl稀释后标本、阴性对照和阳性对照至包被有-nCoV重组抗原的反应孔内，37℃孵育30min，洗涤5次。然后分别在不同反应孔内分别加入μl含不同尿素浓度（0、1、2、4、6和8mol/L）的PBS缓冲液，37℃孵育10min，洗涤3次。然后加入μl辣根过氧化物酶标记的抗人IgM抗体，37℃再次孵育30min，洗涤5次。随后向反应孔内分别加入显色液A和B各50μl，混匀后，37℃避光显色10min。最后向反应孔内加入50μl终止液，以nm为测量波长，nm为参考波长测定反应孔的吸光度值（A值）。结果采用标本A值与临界A值的比值（S/CO值）表示。阳性判断标准：S/CO1.00；阴性判断标准：S/CO≤1.00。样本亲和指数（avidityindex，AI）结果为相应尿素浓度解离后的S/CO值与空白PBS（0mol/L）的S/CO值之间的比值。AI阈值设定为假阳性标本去除离群值后的最高AI值与所有确诊标本最低AI值之间的中间值。标本AI值≥AI阈值时判断为阳性；标本AI值AI阈值时判断为阴性。5．统计学分析：运用SPSS19.0统计软件进行统计学处理。GICA和ELISA2种方法尿素解离前后检测RF-IgM阳性血清-nCoVIgM抗体的特异性比较采用Fisher精确检验，GICA和ELISA2种方法尿素解离前后检测所有对照患者血清-nCoVIgM抗体的特异性比较采用Pearson卡方检验，双侧P0.05为差异有统计学意义。结果
一、不同患者血清-nCoVIgM检测结果采用GICA法和ELISA法检测5份A型流感病毒IgM抗体阳性血清、5份B型流感病毒IgM抗体阳性血清、5份肺炎支原体IgM抗体阳性血清、5份嗜肺军团菌IgM抗体阳性血清、6份HIV感染确诊患者血清、5份高血压患者血清和5份糖尿病患者血清，上述36份血清-nCoVIgM抗体检测结果均为阴性；两种方法检测29份RF-IgM阳性血清，其中18份血清的-nCoVIgM抗体为阳性，见表1；另外，两种方法检测6例COVID-19确诊患者血清，其-nCoVIgM抗体均为阳性。表1GICA法和ELISA法检测不同水平RF-IgM血清-nCoVIgM的阳性情况二、尿素解离前后GICA法的-nCoVIgM检测结果及性能比较采用含6mol/L尿素的PBS对18例-nCoVIgM检测结果阳性的RF-IgM阳性血清和6例COVID-19确诊患者血清进行GICA法的解离试验。其中17例RF-IgM阳性血清的-nCoVIgM检测结果转为阴性，见图1，而6例COVID-19确诊患者血清中-nCoVIgM抗体检测仍为阳性。证实尿素解离可在敏感度不受影响的情况下，提高GICA法对-nCoVIgM抗体检测的特异度，见表2。表2尿素解离前后GICA法和ELISA法的-nCoVIgM检测特异度比较[%（例）]图1尿素解离前后GICA法的-nCoVIgM检测结果三、尿素解离前后ELISA法的-nCoVIgM检测结果及性能比较采用含0、1、2、4、6和8mol/L尿素的PBS对18例-nCoVIgM检测结果阳性的RF-IgM阳性血清和6例COVID-19确诊患者血清进行ELISA法的解离试验。依据试验设定的AI计算方式获得AI阈值为0.46，尿素解离浓度选择为4mol/L时，15例RF-IgM阳性血清的-nCoVIgM检测结果转变为阴性，见图2，而6例COVID-19确诊患者血清-nCoVIgM抗体检测结果仍为阳性。证实尿素解离可在敏感度不受影响的情况下，提高ELISA法对-nCoVIgM抗体检测的特异度（P0.01），见表2。图2不同尿素解离浓度检测-nCoVIgM的亲和指数讨论
-nCoV感染与呼吸道常见病原体感染具有许多相似的临床症状，如发热、乏力和咳嗽等。另外，大部分-nCoV感染肺炎危重症患者存在一定基础性疾病，如高血压和糖尿病等内分泌代谢性疾病[10,11]。因此，本研究在选择对照人群时，充分考虑了上述情况。多篇文献报道，-nCoV感染患者血常规主要表现为淋巴细胞计数下降，因此，本研究也将具有相似现象的HIV感染人群纳入了对照组[1,2,11]。在本研究完成前，本院仅收治COVID-19确诊病例6例，对于两种方法相关检测试剂性能评价势必造成一定的缺陷，但总体趋势较为明显。RF是引起免疫反应干扰的主要因素[12]。采用上述两种方法对对照血清和COVID-19确诊患者血清进行-nCoVIgM检测时发现，除RF-IgM阳性血清对检测结果造成假阳性干扰外，其他对照血清检测结果均为阴性，而确诊血清均为阳性，表明两种方法检测试剂盒均敏感度较好，但特异度有待提高。本研究结果表明，RF-IgM浓度低于70IU/ml时，基本不会对两种方法检测-nCoVIgM结果造成干扰。而另外24例RF-IgM浓度超过70IU/ml的血清中，共计18例出现两种检测方法均为阳性的现象，提示中高水平RF-IgM对两种检测方法的检测结果影响较大。而另外6例较高RF-IgM水平的血清-nCoV检测结果为阴性，这可能与RF-IgM引起交叉反应的部位被封闭有关，尚需要进一步的验证。RF-IgM引起2种方法检测结果假阳性的可能机制为RF-IgM与包被的-nCoV重组抗原发生交叉反应，同时RF-IgM与胶体金标记的抗人IgM抗体或HRP标记的抗人IgM抗体结合，造成检测结果假阳性。RF-IgM阳性会对两种方法检测-nCoVIgM抗体造成干扰，因此当受检血清RF-IgM阳性时，将很难评价-nCoVIgM抗体的真实情况，本研究尝试通过尿素解离的方法来消除或降低其干扰。GICA法加入尿素解离液的时间点选择在液体即将到达上部吸水纸端的主要依据为：（1）经过一定时间的反应，可以使特异性抗原抗体结合更为牢固，不易被随后加入的尿素解离。（2）在该时间点时，加样孔内液体含量很少，不会对随后加入的解离液中的尿素浓度造成较大影响，能很好地保证解离效果。根据文献报道，本研究选择GICA法的尿素解离浓度为6mol/L，结果表明，经过尿素解离后，18例引起-nCoV假阳性的RF-IgM阳性血清中，17例-nCoVIgM结果转为阴性；而6例COVID-19确诊患者血清结果未受影响[13]。因此，该改进方法在保证了检测敏感度的同时，特异度有了明显的提高，检测性能更加可靠。此外，ELISA法的尿素解离浓度为4mol/L，解离时间为10min时，18例-nCoVIgM检测结果阳性的RF-IgM阳性血清中15例检测结果转为阴性；而6例COVID-19确诊患者血清结果也未受影响。经尿素解离实验后，ELISA法获得了和GICA法一致的检测性能，可能与两种方法采用相同的重组抗原和基本一致的检测原理有关。综上所述，当采用上述两种方法检测-nCoVIgM结果为阳性时，应评估血清中RF-IgM水平，并进行尿素解离试验重新检测，以最大程度避免假阳性的风险。同时，本研究结果提示，尿素解离并不能完全消除RF-IgM的干扰作用，因此在解离后-nCoVIgM检测结果仍为阳性时，需要采用RT-PCR进行核酸的确诊。另外，建议所有采用GICA法和ELISA法检测血清-nCoVIgM结果时，均可以采取上述处理方式消除或降低交叉反应带来的影响，提高疑似和高危人群的初筛准确性，有利于-nCoV疫情的评估、防控和制度的制定。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突选自中华检验医学杂志,,43(09)
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