前言
众所周知，ELISA（enzyme-linkedimmunosorbentassay）是一门利用抗原抗体相互作用来定量蛋白、荷尔蒙、抗体或病毒抗原的技术，远在年，德国医学家Behring在动物的血清中发现了一种可以抵抗白喉的抗毒素物质，进而发展了毒素-抗毒素体液学说并在年拿下了诺贝尔奖，年体液免疫学之父PaulEhrlich提出了钥匙理论，打开了免疫学的大门，年，Edelman和Porter完成了抗体的氨基酸测序，将抗体结构真实的摆在了人们面前，也因此拿下年的诺贝尔奖，免疫测试方法也开始迅速的与科学研究相结合，基于Kohler和Milstein在年利用脾脏B细胞和骨髓瘤细胞融合建立了杂交瘤技术，抗体药物的开发就此拉开了序幕，ELISA也开始走进抗体医药研发的视野，到目前为止，全球各期刊每年发表ELISA与抗体检测相关的研究论文达多篇，其中ELISA间接法应用于抗体检测的论文有70余篇（图1），经过数十年的摸索与改进，现共有四种ELISA技术，即ELISA直接法（DirectELISA）、ELISA间接法（IndirectELISA）、ELISA夹心法（SandwichELISA）以及ELISA竞争法（CompetitiveELISA），ELISA技术被广泛的应用于医学诊断、植物病理以及工业研发，推动着人类健康产业的发展，今天我们一起来了解ELISA间接法。
图1ELISA间接法与抗体检测的论文数量ELISA间接法简介图2ELISA间接法
Lindstr?m和Wager在年第一次发表了ELISA间接法的方法，相对于ELISA直接法，它使用酶标记的二抗来进行检测（图2），因为一抗有多个可结合表位，故而提高了检测灵敏度与准确度，就好像在一个黑暗的房间，ELISA直接法只有一个50W的灯泡，而ELISA间接法可以并联上两个50W的灯泡，这样房间的亮度是不一样的，ELISA间接法操作上与ELISA直接法不同的地方，就是多了二抗的孵育（图3）。
图3ELISA直接法与间接法的比较
第一步同样是将抗原被动吸附到多孔板的表面，洗涤并封闭多余的面积，加入含待测抗体的分析样品，孵育至特异性的完全结合，再洗涤孵育上二抗，最后加入底物进行显色反应检测（图4），所以该方法多用来对抗体进行定量分析。非常明显的是，反应的特异性相比直接法提高了，同时也更经济，因为不需要针对每一个特定抗原来设计酶标记抗体，当然引入第二个抗体也带来交叉活力上的影响，这可能导致一定的背景噪音。
图4ELISA间接法操作流程
ELISA直接法与间接法的差异化比较在上一篇ELISA直接法中我们描述了其操作步骤，由于在操作上间接法与直接法区别并不大，因此在本篇中不再赘述，且主要总结一下两者的之间的差异，众所周知，ELISA直接法只需要一个检测抗体，而ELISA间接法的检测过程则分为两步，分别孵育两次，需要两个抗体来完成特异性的结合，现在我们来看看其整体方法上面的差异，有助于我们更好的理解并使用。
表1ELISA直接法与间接法的差异化比较
ELISA直接法
ELISA间接法
?方法灵敏度比较
灵敏度较低
灵敏度更高
?时间消耗
步骤少，时间消耗少
步骤多，需要孵育二抗，时间较长
?抗体使用情况
只需要一种类型的抗体
需要一抗与二抗
?酶标记抗体
酶连接在一抗上
酶连接在二抗上
?交叉活性
只有一个抗体，无交叉活性
有交叉活性，会提高背景噪音
?信号
信号相对较弱
检测信号被放大，信号高
除此之外，补充一些容易被忽略的材料细节，让我们充分的认识到方法测试过程中可能存在的限速步骤，避免陷入大坑，难以自拔。
1.固相材料的选择
蛋白质暴露在表面的侧链氨基酸能与固相载体表面的疏水基团发生相互作用，从而被动吸附于微孔板表面，这种非特异性的结合，受到蛋白质的分子量、等电点以及溶液的PH影响等等，例如IgG对聚苯乙烯等固相载体具有较强的吸附力，被吸附后可保留其免疫原性，加之其价格低廉，所以被普遍采用，现总结了一些固相材料（表2），供参考使用。
表2固相材料
材料
结合能力
互作类型
膜材料
硝酸纤维素
PVDF
尼龙
高
高
高
疏水，亲水
疏水
疏水
板或管
聚苯乙烯
聚乙烯化合物
低
低
疏水
疏水
珠子
聚苯乙烯
衍生化的聚苯乙烯
微粒
适中
高
高
疏水
共价，疏水，亲水
共价，疏水
聚苯乙烯材料虽然能结合大多数的蛋白，但亲水型分子如糖类，短肽链或者是核酸药物分子无法与聚苯乙烯材料形成这样的作用力，因此想保留这些分子，必须使用共价键来连接，如NHS材料等。
图5固相材料的结合力
2.封闭液的选择目前两大封闭液的主要成分是蛋白和表面活性剂，从经验上来看，在一个ELISA试验中合适的封闭液，未必适用于另一个ELISA试验，因此，我们需要了解每一类封闭液的优势与劣势，根据分析的性质选择最实用的封闭液。
表3蛋白封闭液
封闭成分
制备液
优势
劣势
BSA
含1%-5%PBS溶液
便宜，与蛋白A兼容
有交叉活性
缺乏多样性，批次之间有变化
脱脂牛奶
0.1%-0.5%
相对便宜，兼容蛋白A
批次间有偏差
容易快速变坏
酪蛋白或酪蛋白酸
1%-5%
纯度高
容易变坏
血清
5%-10%
能有效封闭非特异性反应
有交叉活性
鱼明胶
1%-5%
对哺乳动物蛋白和蛋白A无交叉活性
有效性低
ELISA试剂盒挑选准则ELISA试剂盒的准确度、精密度特异性等好坏决定了产品质量的好坏，所以我们在参评一个ELISA试剂盒时，需要认真的阅读产品报告，看看其是否合格且高质量。
表4ELISA试剂盒选择标准指标
影响原因
回收率
评估试剂盒测量结果趋于真实值的程度，回收率偏低容易产生假阴性结果
天然样本检测
确保试剂盒可检测天然样本，防止假阴性或假阳性结果的出现
交叉反应
交叉反应越大，试剂盒特异性越大
干扰试验
判断其它分子对抗原抗体互作的影响
稳定性实验
确保试剂盒长期存放的稳定性
精密度和灵敏度
保证实验的检测限以及可重复性
重复性
科学实验讲究重复性，控制变异系数在15%以内
文献引用
高质量的文献引用有非常好的借鉴作用
图6ELISA试剂盒指标（sinobiological）
总结ELISA间接法的出现提升了人们对于通过ELISA技术来解决抗原抗体检测的幻想，作为ELISA间接法基础的发展，它提升了检测灵敏度，将二抗检测变成了现实，使得后续ELISA的检测变的丰富多样，也适用于各种各样的样品。同时，在我们选择ELISA产品时，应该熟读产品报告，根据以上标准进行“鉴雷”，目前国内ELISA厂家良莠不齐，使得很多使用者花费太多时间在找偏差原因，让人困扰，我们希望在未来的时间里，国内ELISA试剂盒能在质量上形成高密度竞争，毕竟，质量把控才是赢得市场的关键。
推荐阅读ELISA发展历程及分类
ELISA间接法学习篇ELISA夹心法学习篇参考资料
1,Lindstr?mP,WagerO.IgGautoantibodytohumanserumalbuminstudiedbytheELISA-technique.ScandJImmunol;7:–25.
2,
