近期，科学家分别成功地将一颗转基因猪的心脏与肾脏移植到了患者的体内，尤其是移植了猪心脏的患者已经存活超过一个月了，目前心脏功能正常且没有免疫排斥出现，实在激动人心。这里我们书接上文，聊一聊这些猪是如何通过基因改造来克服免疫排斥的。
当猪器官进入人体后，会受到全方位的免疫排斥，根据作用时期和相关分子机制，可以分为以下四个类型，即超急性排斥反应，急性体液排斥反应，急性细胞排斥反应及凝血失调与全身性炎症。
1.超急性排斥反应
与同种异体移植不同的是，异种器官进入人体遇到的第一道免疫屏障是超急性排斥反应，在几分钟到几小时内，免疫系统就会破坏破坏移植器官的血管，产生水肿、血栓形成和出血等现象，最终造成器官坏死。
这是由于猪血管内皮细胞表面存在一种人类细胞中并不存在的α-Gal表位（半乳糖-α-1,3-半乳糖），同时人体内还天然存在着大量针对这个表位的抗体，所以当猪器官移植入人体后，预先存在的抗体会立即识别这些表位并激活补体系统，攻击并裂解猪血管内皮细胞，从而破坏移植物的血管系统，这本质上属于一种体液免疫排斥反应。
在α-Gal表位的合成中，GGTA1（α1,3-半乳糖基转移酶1）发挥着重要作用。年，两个实验室分别首次在猪中敲除了GGTA1，建立了GTKO猪。这种猪的细胞表面上没有α-Gal表位，而且近期的猪肾脏移植所用的也是GTKO猪。移植肾在实验观察的54个小时内一直能够正常工作且没有免疫排斥现象，就说明这种基因改造确实能够大大减轻异种移植后的超急性排斥反应。
超急性排斥反应（左）及急性体液排斥反应（右）
图片来自Xenotransplantation:CurrentStatusinPreclinicalResearch（doi.org/10./fimmu..）
2.急性体液排斥反应
急性体液排斥其实与超级性排斥反应类似，是由抗体介导的免疫反应，主要攻击对象是猪血管内皮细胞，临床表现也是移植器官的出血、梗死、坏死、血栓形成。但二者不同的是反应速度，急性体液排斥通常发生在移植后一周至数月内。
这是由于引发急性体液排斥反应的抗原表位Neu5Gc（N-甘氨酰神经氨酸）和DBA反应性多糖（DBA-reactiveglycans，也称为Sd(a)抗原），体内并不存在大量的预先存在的针对性抗体，许多抗体是在移植器官进入人体后才一点点制造出来的，所以反应时间会慢一些。这些抗体在结合相应抗原表位后，会招募补体系统及NK细胞（自然杀伤细胞）将猪血管内皮细胞裂解。
CMAH（CMP-N-乙酰神经氨酸羟化酶）参与Neu5Gc的合成，而B4GALNT2（β-1,4-N-乙酰半乳糖胺基转移酶2）参与DBA反应性多糖的合成，因此敲除这两个基因可使猪细胞表面的Neu5Gc与DBA反应性多糖抗原消失，所以能够大大降低急性体液排斥反应。目前很多转基因猪都会同时将GGTA1、CMAH、B4GALNT2敲除。
另外，从另一个角度来说，抑制补体系统也可降低免疫排斥的杀伤作用。因为补体调节蛋白（CRP）可以抑制补体级联反应，虽然猪源CRP不能有效控制人类补体系统，但可将人源CRP（如DAF、CD46、CD55、CD59和C1-INH等）在猪中表达，这样移植入人体的转基因猪器官就可较少受到补体系统的伤害。
3.急性细胞排斥反应
急性细胞排斥与急性体液排斥类似，也是发生在移植后一周至数月内，但不同的是，急性细胞排斥是针对整个器官的反应，而超急性排斥反应和急性体液排斥反应更倾向于针对血管内皮细胞。异种移植物的细胞排斥反应可由适应性和先天性免疫反应共同介导，T细胞、NK细胞、巨噬细胞等均参与其中。
（1）T细胞
T细胞可以通过直接和间接途径被激活，从而产生对于异种移植器官的排斥。
直接途径：猪APC（抗原呈递细胞）通过SLAI和SLAII（猪白细胞抗原）多肽复合体与人类T细胞的T细胞受体（TCR）相互作用来直接激活T细胞，启动针对猪血管内皮细胞的细胞毒性杀伤。该过程中，APC细胞表面的CD80（也称B7-1）、CD86（也称B7-2）蛋白可与T细胞表面的CD28结合，提供第二信号，促进T细胞的活化。而CTLA-4与CD80/86的结合会抑制T细胞的活性。
间接途径：人类APC识别并处理猪细胞的抗原，然后再将其呈递给T细胞并激活T细胞，进而引发细胞因子释放及B细胞的活化，放大免疫排斥反应。细胞因子会增强NK细胞和巨噬细胞的细胞毒性，而B细胞活化可产生抗体并介导体液排斥反应。
T细胞的直接激活途径（左）及间接激活途径（右）
图片来自Xenotransplantation:CurrentStatusinPreclinicalResearch（doi.org/10./fimmu..）
为了抑制T细胞的活性，可以在猪细胞中直接表达人源CTLA4抗体，使其能够结合T细胞上的CTLA4靶点并将T细胞抑制。不过实验表明该方法无法完全阻断T细胞的激活，但相比之下CTLA4的高亲和力变体LEA29Y可以很强地抑制T细胞活性的抑制，且实验表明，表达人源LEA29Y的猪胰岛细胞确实可免受人类T细胞介导的细胞排斥。
此外，大家耳熟能详的PD-1与PD-L1通路也可用于抑制T细胞介导的免疫排斥。这个机制经常被肿瘤细胞利用，它们可表达PD-1的配体PD-L，从而抑制T细胞的增殖与功能来逃逸免疫攻击。在同种异体移植中，PD-L1的表达可降低肝脏和肾脏移植后的免疫排斥反应。而在异种移植中，表达人源PD-L1的猪器官也可免受人类T细胞攻击。
同时，降低猪源MHC（主要组织相容性复合体）并表达人类MHC也是另一种降低细胞免疫排斥的可行策略。MHCI分子由α链与B2M（β2微球蛋白）组成，所以将人源的MHC表达在猪细胞上，伪装成人类细胞，可能会实现鱼目混珠的效果。另外，尽管敲除B2M基因后可消除猪细胞表面的猪源MHCI分子，但由于B2M缺陷影响猪的存活，因此并不适宜如此改造。
对于MHCII分子，转录激活因子CIITA是其主要调节因子,而CIITA的某些突变会导致MHCII表达缺失，所以可以引入突变的人源CIITA来降低猪细胞上MHCII的表达。实验表明，这种改造可降低体外人源CD4+T细胞反应，减弱猪-狒狒异种移植中的细胞免疫排斥（但效果不明显）。
（2）NK细胞
NK细胞可通过直接途径和抗体介导细胞毒性途径（ADCC）来杀伤异种移植器官。
直接途径：一方面，NK细胞的激活型受体NKG2D和pULBP-1可识别猪细胞上的NKp44等分子。另一方面，NK细胞的抑制型受体KIR、ILT2和CD94/NKG2A对猪源MHCI及SLAI的识别能力差，NK细胞无法被抑制。所以人类NK细胞接触到猪细胞后，会进行攻击。
ADCC途径：除了猪内皮细胞上的半乳糖表位与非半乳糖表位所对应的预制抗体，猪细胞上广泛存在的SLAI也会诱导人体产生抗体。这些抗体的Fc区域被NK细胞上的Fc受体（FcRs）识别后会激活并导致NK细胞释放细胞毒性颗粒，使猪细胞死亡。
在人体中，HLA-E（人类白细胞抗原-E）可以结合NK细胞的CD94/NKG2A受体并抑制其激活。体外实验显示，表达人源HLA-E的猪细胞可以免受人类NK细胞及巨噬细胞介导的细胞毒性并抑制巨噬细胞产生促炎细胞因子，所以也可作为转基因策略之一。
NK细胞（上）及巨噬细胞（下）介导的细胞排斥反应
图片来自Xenotransplantation:CurrentStatusinPreclinicalResearch（doi.org/10./fimmu..）
（3）巨噬细胞
T细胞能够招募并激活巨噬细胞，从而引起浸润。巨噬细胞一方面可以由抗体介导，直接对猪内皮细胞发挥杀伤作用，另一方面会分泌大量促炎性细胞因子（如TNF-α、IL-1、IL-6等），进一步放大免疫排斥反应。
CD47在多种细胞上表达，是巨噬细胞抑制受体SIRP-α的配体，可抑制巨噬细胞的吞噬作用，但猪细胞表面的CD47无法通过SIRP-α受体抑制人类巨噬细胞。所以可以尝试在猪细胞中表达人源CD47。动物间遗体移植实验也表明，人源CD47转基因确实可以抑制人巨噬细胞的吞噬作用，延长移植物存活时间。
其他抑制性分子，如CD,ILT3（免疫球蛋白样转录因子3）、LILRB（免疫球蛋白样受体B）也被报道与巨噬细胞功能有关。
4.凝血失调及全身性炎症
当异种器官进入人体后，通常会伴随着凝血异常。
在人体中，凝血反应大致可分为三个阶段，即多种凝血因子组成的凝血级联起始、凝血酶原的激活及纤维蛋白原的激活。之后，产生的纤维蛋白可以与血小板凝结在一起并粘附在出血部位。凝血级联反应可被内源途径与外源途径激活。
内源途径指参加的凝血因子全部来自血液。血管内皮细胞发生损伤后，血管的胶原基质会暴露出来，将凝血因子XII激活，启动凝血酶联。在高剪切力的环境下，胶原基质中的vWF（血管性血友病因子）也会结合血小板表面的GPIb（糖蛋白1b），从而促进血小板的激活。激活的血小板进一步结合纤维蛋白原，介导血小板聚集和在内皮上的粘附。
但是，猪源vWF能在没有剪切力的环境下也自发地聚集血小板，导致血栓的产生。因此，需要将猪源vWF进行人源化，最近的猪-狒狒移植实验也证实了这种改造策略的效果。
外源途径指激活信号，即组织因子（TF），来自于血液之外。TF一般广泛表达于除血细胞及血管内皮细胞之外的各种组织细胞中。当血管受损后，TF会进入血液循环并与凝血因子VII形成复合体，激活凝血因子X，启动凝血级联。然而在异种移植后，TF会在猪内皮细胞及与其接触过的人类血小板和单核细胞中表达，导致移植器官和人体出现血栓问题。
此外，猪内皮细胞表达的FGL2（类纤维蛋白原2）可以直接将人凝血酶原转化为凝血酶，而不涉及TF，所以也可以考虑将猪细胞的FGL2去除。
在人体中，凝血与抗凝一般应是处于互相对抗的稳态，只有当例如出血等异常现象，稳态才会被短暂打破，但随后也会很快回归稳态。所以，利用人体本身存在的抗凝机制可能是解决猪器官移植后凝血异常的有效方法。
凝血及抗凝机制
图片来自Xenotransplantation:CurrentStatusinPreclinicalResearch（doi.org/10./fimmu..）
人体内存在三种抗凝机制。
（1）TFPI（组织因子通路抑制蛋白）是存在于正常人血浆及血小板、血管内皮细胞中的一种糖蛋白。它通过结合封闭凝血因子Xa或VIIa来拮抗TF的作用。体外细胞实验与猪-非人灵长类动物的器官移植实验均表明，在猪细胞中表达人类TFPI可以抑制凝血、阻止凝血异常的发生。
（2）TBM（血栓调节蛋白）存在于血管内皮细胞上，可与凝血酶及EPCR（内皮蛋白C受体）共同激活PC（蛋白C），而激活的PC会与PS（蛋白S）共同抑制凝血因子Va及VIIIa，从而下调凝血酶的形成并抑制凝血级联。实验表明，表达人源TBM或EPCR都能够抑制异常的凝血。
（3）ADP可以将血小板聚集到损伤部位来激活并聚集血小板。CD39可将ATP分解为AMP，而CD73可将AMP分解为腺苷，这两种酶都能抑制血栓形成。因此表达人源CD39及CD73将有助于克服猪器官移植中出现的凝血障碍问题。
另外，接受异种移植物的受体通常会发生全身炎症反应，并进一步引发凝血紊乱，所以将人类炎症调节基因导入猪基因组是解决这一问题的有效策略之一。例如HO-1（血红素加氧酶-1）及A20（TNFAIP3，肿瘤坏死因子α诱导蛋白3）均为炎症抑制因子，实验表明证明在猪器官中表达人源HO-1或A20能够抑制炎症及血栓形成，延长器官生存期。
目前已有的转基因猪一般会选用以上介绍的数个免疫调节基因做组合。
例如近期的猪心脏移植实验所使用的转基因猪进行了10个基因改造，其中9处与免疫调节相关。敲除GGTA1,CMAH,B4GALNT2是为了消除猪细胞表面的糖表位，过表达人源DAF与CD46抑制补体通路，过表达人源CD47抑制巨噬细胞活性，过表达人源HO1抑制炎症反应，过表达人源TBM抑制血栓形成。
而乔治·丘奇教授与杨璐菡博士联合培育的转基因猪Pig3.0，包含了13种基因改造，其中12处与免疫调节相关。该转基因猪也同样敲除了GGTA1,CMAH,B4GALNT2，又过表达人源CD46,CD55,CD59抑制补体通路，过表达人源B2M,HLA-E抑制T细胞及NK细胞活性，过表达人源CD47抑制巨噬细胞活性，过表达人源TBM,TFPI,CD39抑制血栓形成。
总之，基于现有的免疫学知识及基因编辑工具，猪-人的异种免疫移植的免疫排斥问题已经有了相对完整的解决方案。最近的几次猪器官移植实验就是时代的先声，相信相关的临床试验会越来越多的，而市场化大规模应用就在不远，希望早日能有可使用的产品。
不过除了免疫排斥问题，跨物种间病原体传播也是个巨大的风险，稳定岛将在下一篇文章为大家介绍一下这方面的内容。
感谢阅读！
参考文献：
[1]NiuD,MaX,YuanT,etal.Porcinegenomeengineeringforxenotransplantation[J].AdvancedDrugDeliveryReviews,.
[2]LuT,YangB,WangR,etal.Xenotransplantation:CurrentStatusinPreclinicalResearch[J].FrontiersinImmunology,,10:.
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