1.研究背景
干扰素刺激基因（stimulatorofinterferongenes，STING），是人固有免疫系统的重要组分，而固有免疫系统又是人体对抗诸如细菌以及病毒等外界病原体入侵的第一道防线。STING的激活介导IRF3磷酸化并促进其入核，诱导I型干扰素的产生，通过系列级联反应，激活适应性免疫系统，活化T细胞，介导抗肿瘤免疫应答。STING在多种细胞中均广泛表达，STING的激活在造血细胞，如树突状细胞、巨噬细胞中的作用已得到很好的阐释，但在肿瘤微环境其他细胞组分中的作用研究尚浅。来自韩国CHABundang医疗中心的ChanKim教授及其团队的研究表明：肿瘤血管内皮细胞可能是STING激动剂的另一重要靶点，且内皮细胞STING的激活可以促进肿瘤血管表型和功能的转变，将免疫抑制的肿瘤微环境转变为免疫增强的肿瘤微环境，从而提高免疫治疗的效果。特别是当与抗血管生成抑制剂、免疫检查点抑制剂联合使用时，能够进一步增加STING激活后的抗肿瘤效应。该研究成果于年7月发表在《TheJournalofClinicalInvestigation》上，再次升级了肿瘤抗血管生成联合免疫治疗的研究思路。2.实验结果
Result1内皮细胞STING的表达与肿瘤CD8+T细胞浸润以及患者预后密切相关基于临床样本，作者首先对名乳腺癌患者和名结肠癌患者STING蛋白的表达情况进行评估，结果显示，与没有炎症的组织相比，STING在肿瘤内皮细胞中表达显著升高（1A）。且有意思的是，肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润在高表达STING的肿瘤血管周围也显著增加，且二者呈正相关（1B-D）。在这两种癌症中，与肿瘤内皮细胞STING低表达的患者相比，高表达患者总体生存期更长（1E-F）。并且随着患者病程的发展，肿瘤产生淋巴管浸润，此时内皮高表达STING在延长患者生存期方面体现出更明显的优势。Result2STING激动剂促进CD8+T细胞浸润以及肿瘤血管正常化为了更深入了解STING在调控肿瘤生长中的作用，作者构建了LLC皮下移植瘤模型进行探究。作者首先考察了STING激动剂RR-CDA的使用剂量，将1～ug的RR-CDA注射至LLC皮下移植瘤内，1ug的剂量就可以有效抑制肿瘤的生长（2A-B），而使用5ug或者更大的剂量，则可以显著降低血管密度，增加周细胞覆盖（2C-D）。确定了激动剂的剂量范围，作者通过瘤内单次注射RR-CDA，考察CD8+T细胞的浸润情况以及肿瘤血管的变化。结果显示激动剂注射后的第一天，肿瘤血管急剧减少，随后逐渐恢复。与对照组相比，注射激动剂后，周细胞的覆盖率也逐渐增加，在治疗后第7天，开始涌现大量的CD8+T细胞。周细胞覆盖率与大量CD8+T浸润至肿瘤微环境的时间吻合（2E-F）。为了更进一步剖析STING的激活对于肿瘤微环境的影响，作者通过反复注射激动剂进行考察。同样选取LLC皮下移植瘤模型，瘤内注射RR-CDA2次，与对照组相比，肿瘤体积下降41%，CD8+T浸润增加16.5倍，血管密度下降51%，周细胞覆盖率增加4.4倍，基底膜覆盖增加3.1倍，葡萄糖转运蛋白1的表达降低46%，瘤内缺氧得到缓解（2G-H）。cGAMP是STING蛋白的另一种激动剂，通过瘤内注射cGAMP3次，得到与RR-CDA相类似的作用结果（2I-J）。由此可见，STING的激活可以增加肿瘤内CD8+T细胞的浸润发挥抗肿瘤效应，同时也可以使肿瘤血管正常化，减轻瘤内缺氧。Result3STING信号通路的激活可以同时调控肿瘤血管和免疫微环境上述结果表明STING的激活可能有利于肿瘤血管的正常化，那么这一过程到底是如何调控的呢？在此，作者选用野生型小鼠和STING缺陷型小鼠作为研究对象。结果显示（3A-C），野生型小鼠瘤内注射cGAMP3次，肿瘤生长明显受到抑制，血管密度降低，周细胞覆盖增加；而STING缺陷型小鼠，即使给予cGAMP治疗，肿瘤的生长以及血管也没有发生明显改变，表明cGAMP诱导的抗血管生成作用依赖于STING的表达；此外，未进行cGAMP的治疗的STING缺陷小鼠，与野生型小鼠相比，肿瘤血管密度增加，芽生血管数增加，周细胞覆盖率降低。由此可见STING的激活抑制肿瘤血管的芽生的同时也可以促进肿瘤血管成熟。紧接着，作者对STING激活后的转录情况进行考察。基于NanoString检测技术，作者对比了瘤内注射cGAMP后，野生型小鼠与STING缺陷型小鼠肿瘤组织中个与免疫微环境相关基因的表达情况，结果显示二者之间存在巨大的差异（3D）。首先，STING的激活强烈诱导I型和II型干扰素的产生（3E）。其次，STING激活后，血管稳定因子的表达显著增加；STING缺陷小鼠血管生成稳定因子的表达下降或保持不变（3F）。而二者血管不稳定因子的表达无明显差异（3G）。此外，STING激活后，内皮与淋巴细胞之间相互作用所需的粘附分子的表达也显著升高（3H）。但与此同时，作者也发现STING激活，抑制性检查点分子的表达上调，STING缺失，刺激性检查点分子的表达上调（3I）。流式分析显示相同的结果（3J）。此外，作者还发现，STING激活显著上调M1型巨噬细胞特异性基因的表达，而M2型相关基因的表达没有明显变化（3K）。Result4外源性STING激动剂治疗对造血细胞以及非造血细胞STING激活发挥功能都很重要STING在多种细胞中表达，之前报道的有关STING蛋白的研究主要聚焦于造血细胞，而STING的激活在非造血细胞中的研究尚浅。于是作者在此构建了4种骨髓嵌合小鼠模型进行研究（4A）。通过瘤内注射RR-CDA，结果显示（4B-C），WT-WT，瘤体积显著抑制；KO-WT、WT-KO，瘤体积部分被抑制；而KO-KO，肿瘤的生长几乎不受抑制。以上结果表明无论是在造血以及非造血性细胞中，STING的激活在抗癌疗效中都发挥着至关重要的作用。进一步分析肿瘤组织免疫荧光染色结果（4D-E），有趣的是与KO-WT组相比，在KO-WT组中，小鼠肿瘤组织CD8+T细胞浸润减少，血管密度降低，而周细胞的覆盖却是增加的。因此非造血细胞中STING的激活主要负责调控肿瘤血管；而造血细胞中STING的激活主要调控CD8+T介导的抗肿瘤免疫应答。Result5STING激活对肿瘤微环境的调控依赖于I型IFN和CD8+T细胞活化的STING究竟是如何重塑肿瘤微环境的呢？前面作者已经证实CD8+T的浸润与STING的激活呈正相关，且STING激活诱导干扰素的产生。作者在此进行反向验证，通过腹腔注射中和抗体清除I型干扰素或是CD8+T细胞。结果显示使用中和抗体后，明显削弱了STING激活后的抗肿瘤效应，且消除I型干扰素对抗肿瘤效应的削弱更明显（5A-B）。表现为肿瘤血管密度增加，周细胞以及基底膜覆盖减少，严重影响了STING激活后的抗血管生成以及促血管正常化作用（5C-D）。同时血管稳定因子的表达下调（5G），血管不稳定因子的表达不变或升高（5H）。此外，调控内皮细胞与淋巴细胞互作的粘附因子的表达下调（5I）。以上结果表明，I型IFN、CD8+T细胞对于STING激活后诱导的肿瘤血管重塑是必不可少的，且I型IFN的影响更显著。Result6采用STING激动剂联合VEGFR2阻断治疗可使肿瘤完全消退，并增强促肿瘤血管正常化效应由于IFN是重要的抗血管生成信号，VEGF是关键的促血管生成信号，且血管内皮生长因子诱导的1型干扰素受体的消除是有效的血管生成所必需的。由因此作者猜想通过阻断VEGF受体是否可以进一步增加IFN的产生，从而增加STING激活诱导的血管正常化和抗肿瘤免疫作用？作者基于LLC皮下移植瘤模型对比了几种给药方案的抗肿瘤效果。单独使用STING激活剂cGAMP、VEGFR2阻断剂DC，分别可以使肿瘤生长降低45%、61%，而二者联合使用可以使肿瘤生长降低73%（6A-B）。同时显著降低血管密度，增加周细胞覆盖（6C-D）。同样是LLC皮下移植瘤模型，联合使用STING的另一个激动剂RR-CDA和DC，甚至可以使肿瘤完全消退（6E-G）。此外，我们可以发现，DC与STING的激动剂联合使用显著延长了小鼠生存期（6H）。作者进一步构建了CT26结肠癌皮下移植瘤模型进行验证，得到了相一致的结果（6I-K）。同时作者也使用了相应的中和抗体进行反向验证，结果显示清除I型干扰素、CD8+T细胞可以部分逆转抗肿瘤效应，但是清除巨噬细胞似乎并不会影响联合疗法的抗肿瘤作用（6L）。说明双重联合疗法的疗效很大程度上取决于I型干扰素和CD8+T细胞，而巨噬细胞并不是必须的。Result7STING激动剂、VEGFR2阻断剂、免疫检查点抑制剂三重联合治疗诱导肿瘤消退尽管STING激活介导T细胞发挥有效的抗肿瘤效应，但根据Nanostring分析结果显示STING的激活同样可以诱导抑制性免疫检查点分子的上调，这有可能会产生负反馈回路，抑制STING活化诱导的抗肿瘤免疫效应。因此，作者进一步采用STING激动剂、VEGFR2阻断剂以及免疫检查点抑制剂，三重联合，以最大化实现抗肿瘤效应。结果显示（7A-B），单一使用免疫检查点抑制剂，LLC肺癌显示出明显的抗性；但与STING激动剂联合使用，可以有效延缓肿瘤的生长，甚至使部分肿瘤完全消退；而三者联合使用，可以使超过一半的肿瘤完全消退。三者联合用药显示出明显的抗肿瘤生长优势，且显著延缓了荷瘤小鼠的生存期（7C）。此外，作者将LLC肺癌细胞和MC38细胞分别注射到已经经治疗且肿瘤完全消退的小鼠皮下，结果显示肿瘤消退的小鼠对LLC细胞仍具有免疫攻击能力，表明已经建立长期的肿瘤特异性免疫记忆（7D）。Result8三重联合给药有效延缓了自发乳腺癌模型肿瘤的生长转移由于皮下移植瘤的模型血管不成熟且缺乏适当的肿瘤基质，无法完全模拟真正的肿瘤免疫微环境。因此，作者又选用了自发性乳腺癌模型进行研究。自发性乳腺癌模型相较而言，具有更为成熟的脉管系统以及更加丰富的基质细胞，是研究乳腺癌比较可靠的动物模型。通过分析比较可以发现，治疗3周后，不仅注射药物的肿瘤生长受到明显抑制，其余未注射药物的肿瘤的生长也均受到抑制（8A-C）。说明STING的激活具有绝对的抗肿瘤效果，而联合VEGFR2阻断剂或是免疫检查点抑制剂，抗肿瘤效果更佳。与之前结果相类似，联合给药增加了CD8+T细胞的浸润，降低肿瘤血管的密度，增加了周细胞的覆盖（8D-E）。此外，三者联用显著降低了乳腺癌肺转移（8F-G），且延长了自发性乳腺癌小鼠总体生存期（8H）。3.总结与思考
综合上述研究结果，作者得出结论：通过靶向激活肿瘤血管内皮细胞STING蛋白，可以增加I型干扰素产生以及CD8+T的浸润，促进肿瘤血管正常化，改善免疫抑制微环境。但肿瘤微环境中大量存在的VEGF与I型干扰素对肿瘤血管具有相反的调控作用，且STING的激活会诱导免疫检查点分子的上调，均会影响STING激活后诱导的抗肿瘤免疫应答。因此STING激动剂、抗血管生成抑制剂、免疫检查点抑制剂三者联合使用时，能够进一步增强STING激活后的抗肿瘤效应。人们对于免疫治疗的认识正在不断提升，相较于化疗和分子靶向治疗，抗血管生成治疗和免疫治疗都立足于改善肿瘤微环境，两者互相影响，具有协同效应，是未来研究的重点方向。中医治疗立足于整体，且中药具有多成分多靶点的优势，应用前景广泛，也势必会迎来属于自己的春天。参考文献：[1]ZhangJ,QiaoL,LiangN,etal.Vasculogenicmimicryandtumormetastasis[J].Journalofb.u.on.officialjournalofthebalkanunionofoncology,,21(3):.[2]CorralesL,GajewskiTF.MolecularPathways:TargetingtheStimulatorofInterferonGenes(STING)intheImmunotherapyofCancer[J].ClinicalCancerResearch,:-.[3]Barber,GlenN.STING:infection,inflammationandcancer[J].NatureReviewsImmunology,,15(12):-.[4]ZhuY,AnX,ZhangX,etal.STING:amasterregulatorinthecancer-immunitycycle[J].MolecularCancer,,18(1):.[5]DemariaO,DeGassartA,CosoS,etal.STINGactivationoftumorendothelialcellsinitiatesspontaneousandtherapeuticantitumorimmunity[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,:12832.导师：王爱云稿件编辑：大岩石稿件审阅：王爱云预览时标签不可点
