JamesAllison:Asweunderstandthisbetter,wecanrationallyputtwothingstogetherthatwon’tjustduplicateorcanceleachotherout,butwilldodifferentthingsthatcanatleastbeadditive,ifnotsynergistic.
肿瘤免疫治疗在早期经历了漫漫上百年的探索，迷茫和挣扎。随着s年代晚期T细胞活化的第二信号即协同刺激信号（costimulatorysignal）的发现[1]，及随后s年代T细胞活化的协同抑制信号（coinhibitorysignal）即免疫检查点（immunecheckpoint）的揭示[2]，为肿瘤免疫治疗带来了创新思路和曙光，肿瘤免疫治疗进入了快速蓬勃发展期。其中针对调节免疫检查点或协同刺激信号的IO治疗发展最迅猛（图1）[3-4]，从年第1支免疫检查点抑制剂即anti-CTLA-4单抗ipilimumab的问世，短短5年间又有3支anti-PD-1/PD-L1单抗相继获批用于多个瘤种的治疗。IO治疗无论在国外还是在国内已成为肿瘤研发最火热的“兵家必争之地”，在anti-CTLA-4和anti-PD-1/PD-L1单药治疗研发“开疆拓土”的同时，还有多种多样肿瘤免疫治疗的“重量级武器”正在火热研发中，此时“兵家”必然都会思考同一个问题：联合治疗会不会“杀伤力”更广更强？
图1，T细胞活化的协同刺激信号和协同抑制信号
其中走在最前的当数anti-CTLA-4和anti-PD-1/PD-L1的联合，在多个瘤种的联合治疗正在火热临床研究中，其中ipilimumab和nivolumab（anti-PD-1）的联合治疗已获批用于恶性黑色素瘤的治疗。那么，同为针对免疫检查点的阻断，调节T细胞的免疫应答，anti-CTLA-4和anti-PD-1/PD-L1仅仅是“add-on”的叠加作用，实现的是“1+1=2”，还是不同MOA的协调作用，实现的是“1+12”？这就要看CTLA-4通路和PD-1通路的功能到底是相似还是不同。了解一条通路的功能，最简单粗暴的方式就是建立敲除这条通路的转基因小鼠模型。敲除CTLA-4导致小鼠在出生的3-4周即发生多器官严重炎症而死亡，这种炎症发展快速，累及全身组织器官，而且与小鼠的遗传背景无关；而PD-1敲除小鼠，自身免疫性炎症发展缓慢，以累及某些特定组织和器官（如关节，肾，胰腺，心脏等）为主，而且与小鼠的遗传背景有关[5-6]。从这点上我们就可以直观看到，CTLA-4通路和PD-1通路功能存在大不同。
免疫检查点通路的功能，毫无疑问必然是和免疫检查点受体和配体表达的部位或者细胞及结合的亲和力紧密相关。而免疫检查点受体和配体在细胞的表达往往又随着细胞的状态（如免疫细胞处于初始，静息还是活化状态）或细胞所处的微环境（炎症微环境）发生着动态的变化。所以，欲知CTLA-4通路和PD-1通路的功能，先要了解CTLA-4和PD-1本身，及配体表达的部位和和动态变化的规律。
大不同的基础：CTLA-4和PD-1及配体表达部位的不同
CTLA-4和配体B7(CD80或B7-1,CD86或B7-2)分子表达非常局限，主要表达在免疫细胞。初始T细胞不表达或表达微量CTLA-4，在T细胞活化的24-48小时内CTLA-4诱导性表达并达到最高峰。而调节性T细胞（Treg）细胞组成性表达CTLA-4。CTLA-4的配体B7分子主要表达在专职抗原呈递细胞（professionalantigen-presentingcell,APC）上，并且在APC活化后表达上调[1]。
同样，PD-1的表达主要集中在免疫细胞。初始T细胞不表达PD-1，在T细胞活化后表达上调。Treg细胞组成性表达PD-1。初始T细胞不表达或表达少量PD-L1，在T细胞活化后表达上调。而PD-1的配体PD-L1表达比较广泛，除了免疫细胞表达外，有多种外周组织表达PD-L1和/或PD-L2。血管内皮细胞，胰岛细胞，及免疫豁免区的细胞（如胎盘，眼）组成性表达PD-L1；多种肿瘤细胞表达PD-L1。相对PD-L1，PD-L2的表达比较局限，表达比较低，主要也是集中在免疫细胞，如DC和巨噬细胞在活化后诱导性表达，另外有少量肿瘤也表达PD-L2（图2）。但是PD-L2与PD-1结合的亲和力强于PD-L1与PD-1的结合（从这点看，对于某些肿瘤，对PD-L2与PD-1结合的阻断非常重要）。免疫细胞和外周组织及肿瘤细胞PD-L1和PD-L2的表达在促炎症因子如I型和II型干扰素（IFN），TNF-a的诱导，其中IFN-g是最强的诱导因子。因此，PD-L1和PD-L2的表达随着所处微环境细胞因子的变化而发生着动态变化[2,5,6]。
图2，CTLA-4及配体B7分子的表达，PD-1及配体PD-L1/PD-2的表达
从以上表达部位的特征来看，即CTLA-4及配体B7分子主要表达在免疫细胞，而PD-1的配体PD-L1和PD-L2表达相对比较广泛，除了免疫细胞外，大量外周组织和肿瘤细胞表达PD-L1，提示CTLA-4通路的作用主要发生在淋巴结部位；而PD-1通路除了在淋巴结部位的作用外，更多的是对T细胞在外周发挥效应的调节。
大不同（1）：在淋巴结部位，CTLA-4通路和PD-1通路对T细胞活化发挥不同的调节功能
初始T细胞在淋巴结发生活化，增殖和分化为效应T细胞（CD4+T细胞和CD8+T细胞），随后迁移到外周靶器官和组织，才能发挥效应（杀伤肿瘤细胞）。因此，效应T细胞在外周发挥效应的幅度和质量，取决于在淋巴结部位的活化程度和质量。而T细胞活化的程度和质量除了依赖于APC呈递抗原的刺激（第1信号），协同刺激信号（第2信号）与协同抑制剂信号的平衡也非常关键[4]。CTLA-4和PD-1通路作为协同抑制信号，在淋巴结T细胞活化过程中发挥着重要作用，但两者通过各自不同的机制，作用在T细胞活化过程中的不同时间点，对T细胞活化，增殖和分化的发挥着不同的调节作用。
CTLA-4通路在T细胞活化中的作用，有两个理论可以解释：一个是“ThresholdModel”，另一个是“AttenuationModel”[1]。初始T细胞虽然只表达微量的CTLA-4，但这微量的CTLA-4在一些情况下足以决定T细胞的活化是否能够启动。初始T细胞活化的双信号一个来自于APC呈递的抗原与TCR的结合（第1信号），一个来自于T细胞组成性表达的CD28分子与APC表达的B7分子的结合（第2信号）。这里我们看到CD28分子与CTLA-4的配体相同，都为B7分子，但是CTLA-4与B7分子尤其是B7-1分子结合的亲和力是CD28分子与B7分子结合的50-倍[7]（图3）。因此，当APC的B7分子表达比较低的情况下，初始T细胞表达的微量CTLA-4足以竞争过CD28分子，导致在T细胞活化的最早阶段即启动阶段，与B7分子结合的主要为CTLA-4，抑制T细胞活化的启动，即为“ThresholdModel”。而当APC的B7分子表达较高的情况下，B7分子与初始T细胞的CD28分子结合占主导，T细胞启动活化。在活化的24-48小时内，活化T细胞逐渐上调CTLA-4的表达并达最高峰，这时CTLA-4与B7分子的结合占主导，抑制终止T细胞的活化，使T细胞的活化控制在一定范围内，即“AttenuationModel”（图4）。结合这两个理论，anti-CTLA-4能够降低T细胞活化的阈值，既可以恢复早期T活化的启动（质，决定能否活化），又可以延长T细胞的活化（量，T细胞活化增殖的程度），这也就意味着anti-CTLA-4具有将“冷肿瘤”（coldtumor）转变为“热肿瘤”（hottumor）的潜力。研究发现在ipilimumab阻断CTLA-4通路时，确实证实了外周T细胞克隆多样性（TCRdiversity）增加[8]。
图3，CTLA-4与B7分子结合的亲和力是CD28分子与B7分子结合的50-倍
图4，CTLA-4通路对T细胞活化的调节
而PD-1通路主要作用在T细胞活化的后期阶段，在T细胞活化后表达PD-1，与APC的PD-L1/PD-L2结合，主要抑制TCR信号，从而抑制T细胞的增殖，细胞因子的产生和T细胞的存活[8]。因此，PD-1信号通路基本不会影响T活化的启动与否，对质没有影响很小，主要影响T细胞增殖的幅度和存活。对PD-1通路的阻断（anti-PD-1/PD-L1），不会增加外周T细胞克隆的多样性，但会增加特定T细胞克隆的细胞数量。
以上在淋巴结部位，CTLA-4和PD-1通路的不同调节功能，也是anti-CTLA-4往往比anti-PD-1/PD-L1的免疫介导的AE发生率高，而且发生谱也不一样的主要原因之一。
大不同（2）：在肿瘤微环境中，PD-1通路对T细胞效应和衰竭的影响
前面提到虽然PD-1通路在淋巴结部位对T细胞的增殖等有调节作用，但PD-1通路由于其配体表达的特殊性，其功能主要体现在外周，对T细胞效应和功能的调节。
在肿瘤微环境中，在促炎症因子的诱导下，多种肿瘤表达PD-L1或少量肿瘤表达PD-L2，或表达上调。效应T细胞表达的PD-1，与肿瘤细胞表达的PD-L1/PD-L2结合后，抑制TCR信号，抑制效应T细胞对肿瘤的杀伤功能。另一方面，T细胞长期表达PD-1抑制性受体，发生T细胞衰竭（Tcellexhaustion），逐渐失去杀伤功能，最终可导致T细胞死亡[9]。因此，anti-PD-1/PD-L1，不仅可以恢复效应T细胞对肿瘤细胞的杀伤功能，也可逆转T细胞衰竭，恢复T细胞功能[5]（图5）。
图5，PD-1通路对抑制T细胞的杀伤效应和导致T细胞衰竭
大不同（3）：CTLA-4通路对Treg细胞抑制功能的影响
Treg细胞组成性表达CTLA-4，CTLA-4通路是Treg细胞发挥免疫抑制功能的重要机制。Treg细胞表达的CTLA-4能够隔离或阻断APC表达的B7分子与T细胞CD28分子的结合，从而抑制T细胞的增殖和效应功能。Anti-CTLA-4，可以抑制Treg细胞对T细胞的抑制，从而增强T细胞的增殖和功能。另外一个比较特殊的是，ipilimumab除了对Treg功能的抑制外，还能通过ADCC作用，删除肿瘤微环境中的Treg细胞（详解见上一篇：甲之蜜糖，乙之砒霜：免疫检查点抑制剂的ADCC作用）。在ipilimumab治疗黑色素瘤时，证实了在肿瘤微环境中，Treg细胞数量的减少[10]。而Treg细胞虽然也组成性表达PD-1，但PD-1通路在Treg细胞中的作用，目前还不明确。
Treg细胞在外周的免疫抑功能，包括对自身免疫反应的抑制。Anti-CTLA-4解除了Treg细胞的抑制作用，相应会导致自身免疫反应的发生。这是为什么anti-CTLA-4比anti-PD-1/PD-L1由免疫介导的AE发生率高的另一个主要原因。
从以上对T细胞应答的多个环节的调节来看，不得不感叹免疫系统是如此的复杂而又精妙，乃至每一个检查点通路都有其独特的功能和分子机制，在T细胞应答的不同时间点，不同部位，发挥着独一无二的调节作用，为联合anti-CTLA-4和anti-PD-1/PD-L1奠定了理论基础。对于anti-CTLA-4，作用在T细胞活化的早期阶段，使活化T细胞克隆多样性增加，即“海陆空部队”全面启动；而anti-PD-1/PD-L1，使“前线部队的人数和战斗力加强”。两者相互配合协调，调节T细胞抗肿瘤免疫发挥最强效应[11]（图6）。当然，对于CTLA-4和PD-1通路依然有很多未知有待发现，随着对未知的发现，我们对这种联合合理性及产生的临床效应会有更深理解。
图6，联合anti-CTLA-4和anti-PD-1/PD-L1，从不同环节和机制调节T细胞抗肿瘤免疫应答
参考文献
1.ChambersCA,KuhnsMS,EgenJG,AllisonJP.CTLA-4-mediatedinhibitioninregulationofTcellresponses:mechanismsandmanipulationintumorimmunotherapy.Annualreviewofimmunology;19:-94.
2.BoussiotisVA.MolecularandBiochemicalAspectsofthePD-1CheckpointPathway.TheNewEnglandjournalofmedicine;:-78.
3.MellmanI,CoukosG,DranoffG.Cancerimmunotherapy治白癜风西宁哪家医院好怎样治白癜风
