获得性免疫缺陷综合征（AIDS）又称艾滋病，该病会直接导致人类免疫系统功能缺陷，是由人类免疫缺陷病毒（HIV）引起的严重影响人类健康的传染病，HIV-1以全球基因亚型多样性为显著特征。世界卫生组织公布的年全球10大健康威胁中，艾滋病位列其中，足以表明艾滋病的诊治与预防继续受到了国际社会的重视。又由于AIDS具有高致病性和高传染性，所以对疑似AIDS患者的早期筛查和诊断就显得格外重要。本文主要从HIV抗体、HIV抗原、HIV核酸检测、基因芯片几个方面简要阐述有关HIV实验室检测技术的研究进展，以期探索HIV实验室检测新技术的发展提供一定素材。
是由人免疫缺陷病毒（HIV)所引起的慢性致命性传染病。HIV特异性侵犯并破坏辅助性T淋巴细胞（CD4＋T淋巴细胞），使机体多种免疫细胞受损。据统计，在全球的艾滋病感染者中，15-24岁的青少年群体约占40%，这表明艾滋病给正处于快速成长阶段的青少年的身体健康带来了恶劣的影响[1]，年根据国家卫生健康委员会通报信息，1月至10月，全国HIV检测共2.3亿人次，新报告发现HIV感染者13.1万例，至年10月底，全国报告存活的HIV感染者有95.8万，整体疫情持续处于低流行水平。年1-10月新报告的HIV感染者中，异性性传播占73.7%，男性同性性传播占23.0%，性传播已成为我国艾滋病的主要传播途径[2]。在受艾滋病毒影响最严重的地区如东部和南部非洲，新感染艾滋病毒的人数减少幅度最大，年以来减少了30%，但还有约50个国家新感染艾滋病毒的人数在增加[3]。
本病潜伏期长，约2-10年可发展为艾滋病。病人和HIV无症状病毒携带者是本病的传染源，病毒主要存在于血液、精液、子宫和阴道分泌物中，其他体液如唾液、眼泪和乳汁也有传染性。感染早期可有急性感染的表现。然后在相当长的时间内，可无任何症状，或仅有全身淋巴结肿大，晚期出现发热、消瘦、慢性咳嗽、慢性腹泻以及头痛、癫痫、下肢瘫痪等神经系统症状，因免疫功能严重缺陷常发生机会性感染及肿瘤.
正是由于HIV的高致病性和高传染性，对疑似HIV感染者进行早期筛查和诊断显得尤为重要。目前主要检测方法包括HIV抗原检测、HIV抗体检测、HIV核酸检测等，其中HIV抗体检测因操作便捷被广泛应用［4］。HIV抗原测定和核酸定性检测等作为抗体检测的补充方法，是AIDS早期诊断、辅助判别、病情监测、选择相应临床治疗方案和药物疗效评估的重要依据。本研究针对近几年HIV实验室相关检测方法的研究进展和总体发展趋势进行阐述，现报告如下:
1.HIV的基因组
HIV的基因组为两个拷贝的单股正链RNA,两单体的5′端有氢键结合成二聚体,5′端有帽结构,3′端有poly(A)尾。除具有逆转录病毒的基本结构LTR、gag、pol、env基因外,HIV基因组还含有极其复杂的调控基因.现报道的主要有tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、tev、vpx基因等[5]。长末端重复序列(LTR)位于HIV基因组两端,富含重要的顺式调控元件。已证明在其内部含有启动子、增强子、负调控区及许多细胞转录因子结合位点。一些病毒蛋白对LTR有反式激活作用,能引起HIV基因表达。Gag基因负责编码一个分子量为55ku的核心蛋白前体和分子量为ku的gag-pol聚蛋白,gag前驱蛋白被pol基因产物蛋白酶裂解为成熟的p17、p24、p9和p6,这4个蛋白质组成了HIV内部核心骨架。pol基因编码病毒复制所需的酶系,gag-pol聚蛋白被蛋白酶降解成蛋白酶pol、逆转录酶p66/51及整合酶p32。Env基因编码HIV包膜糖蛋白,其初产物为88ku的蛋白质,经糖基化后成为分子量ku的包膜糖蛋白前体,gp经宿主细胞的修饰加工成膜蛋白gp和跨膜蛋白gp41。由两个外显子构成的tat基因所编码的14ku碱性蛋白是一个极其重要的发挥正调控作用的反应激活子,其结合靶点主要是LTR序列中的TAR单位、SPI或NFKB结合位点。其主要功能是增强mRNA转录的起始和延伸效率,它的正确表达为HIV复制所必需。Rev基因由两个外显子组成。编码分子量为19ku的病毒表达调节因子rev蛋白,rev蛋白对结构基因有正调控作用,而对调节蛋白有负调控作用,其功能是促进基因表达由早期调节蛋白mRNA的转录向晚期结构蛋白mRNA的转录转化。其他基因的结构和功能尚待进一步研究[6]。
2抗体检测
2.1ELISA法
ELISA法的应用范围最广泛，适合用于大批量标本的筛查。也是国内抗HIV初筛的主要方法。ELISA是将抗原或抗体吸附于固相载体表面并应用酶标记抗原抗体反应的技术，具有载体易于标准化等优点.一般采用间接ELISA法，原理为采用HIV抗原包被固相载体后与血清样本相互发生作用，再利用酶标记的抗人免疫球蛋白抗体与底物的显色反应，检测被测样本中是否有HIV抗体的存在。目前，ELISA检测相关试剂已发展至第4代。HIV-1感染ELISA检测试剂盒已发展至第４代。第1代试剂盒于年3月面世，采用的是间接法，因而灵敏度和特异性不高，常出现假阴性和假阳性。年面世的第2代使用基因重组或合成多肽抗原的HIV诊断试剂盒，检测HIV-1感染的窗口期比第一代诊断试剂盒缩短了约20天，灵敏度和特异性也有所提高，但易发生漏检。年面世的第3代HIV诊断试剂盒用双抗原夹心法，灵敏度进一步提高，检测HIV-1感染的窗口期也进一步缩小。第4代HIV诊断试剂盒用于HIV-1／HIV-2抗体与HIV-1O亚群抗体及ｐ24抗原的联合检测。相比于第3代筛查试剂，第4代试剂盒增加了P24抗原的检测，极大地缩短了检测的窗口期[7]。郑艳梅等对份标本的检测结果表明，第3代试剂特异性较好而第4代试剂敏感性较高，因而建议第3、4代试剂联合应用，以避免漏检[8]。但ELISA检测HIV抗体存在一定的假阳性反应，因此需对初筛阳性反应的标本进行WB确证。究其原因：(I)可能由于一些传染病病原体与HIV某些抗原决定簇有交叉反应［9］（II）一些标本存在溶血、脂血、微生物污染等现象，增大了HIV抗体假阳性率，实验室人员应拒收不格标本［10-11］。
2ECLIA法
ECLIA法是综合生物素－亲和素技术、电化学发光技术及磁性微珠包被技术等多种先进技术可大幅度提高抗HIV检测的灵敏度，该方法因线性范围宽、标记物有效期长、灵敏度高、无有害污染、可实现自动化而得到学者的青睐，ECLIA的主要原理是将酶或发光物质标记在抗体或抗原上，待免疫反应结束时，加入酶底物或氧化剂，光电倍增管测量光强度，复合体的浓度与光强度线性关系，利用光强度得出待测品物的含量[12]。且韩春俐研究采SYSMEX-HISCL-，全面实现了检测的标准化及自动化，有效降低批内、批间的误差，可为临床提供更加精准的检测结果，但目前研究资料甚少。
韩春俐，研究结果显示ECLIA检出阳性27份，检测阳性率为0.%，ELISA检出阳性29份，检测阳性率0.%，两种方法检测出的29份阳性血样经确证中心检测确证有27份为阳性血样。ECLIA的临界值(CO)分布以-临界指数最多，在阳性血样中占63.0%;ELISA以1.35-1.80临界指数最多，在阳性血样中占59.3%，比较有统计学差异。研究提示ECLIA检测的抗HIV的准确性明显高于ELISA，应用价值更高[13-14]。
2.3WesternBlot法
蛋白印迹试验（WB）主要是基于HIV不同抗原组分的分离以及浓缩和纯化，能够检测针对不同抗原成分的抗体。WB法是用聚丙烯酰胺凝胶电泳将HIV的蛋白进行分离，再经传移电泳将不同的蛋白条、带转移到硝酸纤维膜上，加入病人的血清进行孵育后，用抗人球蛋白酶标示抗体的染色，就能测出不同结构蛋白的抗体。检测结果若发现2条以上的特异带，即提示HIV呈阳性；若未见特异带，则表示HIV呈阴性[15]。由于HIV抗原的免疫原性不同，且个体对HIV抗原的免疫应答强弱不同，导致HIV进入不同个体后产生抗体的时间、浓度和滴度也不尽相同。ＷＢ因其高特异性和敏感性，是国内HIV抗体确证实验室的首选方法，免疫印迹试验（WB）和ELISA对比具有明显的特异性特点，然而对可疑标本的判定依然存在一定的缺陷［16］。艾滋病抗体难以确定的主要原因：⑴HIV早期感染，⑵非特异反应，尤其是非特异反应更为常见［17］。许多不确定结果给患者本人和后续的随访工作带来极大的困难。
3HIV抗原检测
3.1HIV核酸检测
核酸检测是目前最敏感的HIV检测手段，其测定方法大致上分为反转录聚合酶（RT-PCR）（FQ.PCR可以进行实时监控，改变了传统的PCR扩增后进行终点检测,比如国内代表的达安基因）、分支DNA信号放大系统（bDNA）、核酸序列依赖性扩增（NASBA）和连接酶酶促链式反应（LCx）4种。实时荧光定量PCR检验方法是在荧光基团标记探针检验方法的基础上发展起来的，主要包括荧光基团和猝灭基团。若检验时未见PCR发生扩增，则两种基团的距离拉近，最终导致荧光基团不再发出荧光。若检验时有PCR的扩增变化，荧光标记的特异性探针和引物之间发生结合作用，荧光探针发生水解作用，释放荧光基团，从而发出荧光，当探头检测到荧光后，对其进行实时分析病毒的载量，进行HIV感染情况的分析[18-19]。
目前临床上应用的自动PCR检测系统能够将PCR扩增过程和检测限值在单个反应管中进行，避免了实验过程中的污染。有研究使用病毒核酸载量法和HIV-1RNA的巢式反转录PCR（nestedRT-PCR）法与WB方法进行对比，研究结果发现该研究表明对只有gp、p24和gp、gp、p66、p24的特殊阳性标本和以p24为主的抗体不确定标本需要用RT-PCR或NASBA方法进行核酸检测，以进一步确认。在不确定标本的鉴定方面，缪礼锋将核酸定量方法与血清学方法进行比较，结果发现针对env带的不确定标本预示有较大的感染风险，尤其是gp、gp和gp、p24两种带型，须做进一步的随访和鉴别诊断.应当视情况采用核酸方法鉴别诊断.病毒载量检测是鉴别不确定标本的有效方法[20]。核酸检测技术能够进行定性定量的检测，并且特异性强、灵敏度高，但由于所需的试剂、仪器昂贵，费用高，真正运用到常规检验工作中存在一定难度。据报道，超过90%血液漏检导致输血患者感染HIV病毒的原因在于窗口期问题。目前，窗口期已经成为引起HIV漏检和威胁血液输血安全的重要原因［21］。现如今，我国多个血液中心逐渐重视使用核酸检测对病毒进行检查，由此可见，对于不确定的HIV检测结果，可增加核酸试验增强检测的敏感度和提高准确度［22］。
品牌中山大学达安基因股份有限公司
1大包装，48人份/盒；单管单人份，48人份/盒.
2本试剂盒适用于定量检测人血清或血浆样本中免疫缺陷病毒1型核酸RNA的含量。
3本试剂盒利用荧光PCR技术，以HIV基因中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样本核酸纯化之后，通过一步法RT-PCR对HIV-1RNA进行快速定量检测。另外，本试剂盒还带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。
4试剂盒有效期为9个月，PCR检测试剂、质控品、阳性定量参考品组分保存于-20±5℃，核酸提取试剂组分保存于室温。
3.2.PoolingPCR
在艾滋病防制中，找到病毒感染者并加以有效管理是控制艾滋病流行的有效方法。最理想的情况是，在病程早期即急性感染阶段即将HIV病人诊断出来，从而避免配偶/性伴之间的传播[9]。因方法本身的局限性，用抗体检测技术筛查高危人群时，会导致“漏掉”病程早期（急性感染期）的那一部分感染者；因为，人体免疫系统接触到病毒后一般要4周左右的时间才能产生较高滴度的抗体，所以，使用HIV抗体检测方法难以发现早期艾滋病病毒感染者。它是一种核酸检测技术，它可以检测出有高危行为者的血样中的HIV病毒RNA，在疾病早期就可以对就诊病人的艾滋病病毒的感染状况做出诊断，近期，唐翼龙收集4家医疗机构留存的4类人群的HIV抗体阴性血样，对血样进行PoolingPCR法检测，并计算人均检测成本，结果男男同性恋人群HIV核酸阳性率为.27/万，性病门诊就诊者人群次之，为不低于.13/万，体检人群没有发现HIV核酸阳性；医疗机构1(结核病防治机构）的其他就诊者人群核酸阳性率（≥85.54/万）要高于医疗机构2的其他就诊者人群（≥21.04/万）。4个医疗卫生机所留存的4类人群的抗体检测阴性样本中有2类人群检出HIV病毒核酸阳性，共检出病程早期（HIV抗体阴性，但核酸阳性）样本3例，其中男男同性恋人群检出2例、性病门诊就诊者人群检出1例。PoolingPCR检测技术方法敏感且经济，适合于在男男同性恋、性病门诊就诊者及结核病病人等HIV高危人群/高度可疑病人中发现病程早期HIV病毒感染者。PoolingPCR技术较抗体检测方法更为敏感[23]。
4?基因芯片技术的应用
基因芯片技术，又称DNA芯片或生物芯片技术，是近几年新兴的生物技术。此技术的核心原理主要是在支持物上将特定探针分子进行有规律地排布，再将探针分子与待测标记样品进行杂交，利用激光共聚焦技术扫描芯片探测杂交信号的强弱和位置分布情况，再利用计算机软件统计探针上的荧光信号，对其进行对比分析从而得出结果。基因芯片检测技术效率高、速度快，可在短时间内获得所需信息。早在年，Hauser等［24］就利用DNA芯片技术在HIV感染患者出现抗体反应前从其体内检测到了HIV。近期，有研究报道利用表面等离子共振成像（SPRi）生物芯片平台建立HIV-1感染快速检测方法并将其应用于临床标本的检测。通过文献分析
比较筛选出最适检测蛋白，再通过梯度稀释法确定其适宜检测浓度，建立HIV-1感染检测方法并进行优化，然后用已知标本HIV-1阳性血清，进行检测以确定该方法的特异性；用优化的HIV-1检测方法检测已知标本，只有HIV-1阳性血清出现阳性信号[25]。由于基因芯片技术直接测定HIV病原体，一定程度上解决了因基因变异和低拷贝样本造成的漏检问题，提高了样本检测的准确性［26］。目前应用DNA芯片技术在艾滋病患者出现抗体反应前检测HIV。对艾滋病的早期诊断有十分重要的意义。基因芯片的发展包括以下几个方面应用：①单链DNA片段芯片的应用，单链DNA片段可以最优化地反映其所代表的基因。②单核苷酸多态性（SNP）芯片的应用，SNP指基因组中微小的基因序列差异。SNP谱不仅可用更精确的个体识别，而且可用于个体疾病易感性的检测。③比较基因组杂交（mCGH）的应用④基因表达谱检测应用。⑤疾病诊断基因芯片应用。
5展望
伴随着艾滋病在我国的流行，HIV感染已由特定人群向一般人群扩散，感染人群多元化，感染人数也不断增加，国家对艾滋病自愿咨询检测工作的不断推进，承担艾滋病相关监测和检测的实验室工作量也不断增加。预防艾滋病是我国公共卫生工作的一项重要任务，关键寻找一种检测方便、特异性和准确性相对较高的检测方法，对实验室工作人员和被检测人员都有很大的益处.
目前国产的各种艾滋病诊断试剂、病毒载量定量检测试剂、唾液检测试剂、尿液检测试剂都已开发并推广使用.国家鼓励各级医疗机构建立艾滋病筛查实验室，在疾病预防控制机构、妇幼保健机构和社区卫生服务中心建立自愿咨询和检测门诊，扩大检测。积极为我国的艾滋病科学防治工作提供新的模式，助力于降低艾滋病新发感染率和遏制HIV的传播。HIV的实验室检验方法正处于快速发展和不断革新的特殊时期，HIV病毒的检测方向主要包括进行免疫学抗体抗原检测和进行分子生物学核酸检测两个方面，前者以酶联免疫吸附实验、免疫荧光检查等检验方法为主，后者包括了原位杂交检测、聚合酶链反应（PCR）检测、病毒载量的定量PCR检测等检验方法。
特异、准确、快捷、灵敏、自动化是HIV实验室检验方法的主要发展成就，也继续是将来一段时期的主要发展方向。
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