目录
肿瘤细胞免疫治疗之CAR-T技术
1CAR-T技术原理
1.1过继性细胞治疗
1.2CAR-T的治疗过程
1.3CAR-T的结构
1.4CAR-T的抗体结构
1.5CAR-T的基因修饰方法
1.6CAR-T的技术优势
1.7CAR-T的技术风险与解决方案
2CAR-T技术的应用
2.1血液肿瘤
2.2实体肿瘤
一
CAR-T技术原理
1.过继性细胞治疗
过继性细胞治疗是细胞免疫治疗一个主要的研究方向。过继免疫细胞输注（adoptivecelltransfer,ACT）属于肿瘤的被动免疫疗法，指的是分离肿瘤患者自体肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocytes，TIL)或者外周血淋巴细胞，在体外加以分选、扩增、活化，并回输至患者体内。
在恶性黑色素瘤和肾细胞癌，TIL是常用的ACT治疗。TIL是浸润于肿瘤中的淋巴细胞，分离后在IL-2等因子作用下进行体外扩增，最后再回输到患者体内。然而，多数情况下无法应用TIL：有些患者缺乏肿瘤标本或肿瘤和转移灶中TIL很少；获得新鲜的肿瘤组织并分离和扩增TIL具有难度；回输的TIL细胞功能受损，在体内往往不能有效识别肿瘤细胞;肿瘤中强大的免疫抑制微环境降低回输细胞的杀伤能力。这些问题限制了TIL的广泛应用，仅对如恶性黑色素瘤和肾细胞癌的少数肿瘤有一定疗效，对大多数肿瘤疗效欠佳。
在这种情况下，ACT需要使用外周血淋巴细胞。目前使用外周血淋巴细胞的ACT包括淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokineactivatedkillercells，LAK）、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-inducedkiller，CIK）、树突细胞-细胞因子诱导杀伤细胞（dendriticcells-cytokineinducedkiller，DC-CIK）、抗CD3抗体诱导的活化杀伤细胞（anti-CD3antibody-inducedactivatedkillercells,CD3-AKcells）等。然而CIK等是非特异性活化的淋巴细胞，缺乏肿瘤特异性反应能力。在这种情况下，科学家开始通过基因修饰，将识别肿瘤抗原的T细胞受体（Tcellreceptor,TCR）或CAR基因导入淋巴细胞使之成为TCR基因修饰T淋巴细胞（TCR-T）或CAR-T细胞，使之具备肿瘤抗原靶向识别能力。
2.CAR-T的治疗过程
简单来说，CAR-T治疗过程为包括从病人外周血中分离淋巴细胞T细胞，通过基因载体将肿瘤抗原特异性CAR基因转导入T细胞，生成CAR-T细胞，经体外扩增达到一定数量后静脉回输给患者。由于被转录的CAR基因编辑的功能，回输的CAR-T可以特异性结合癌症细胞，从而达到靶向治疗的作用。
3.CAR-T的结构
3.1CARs结构总览
CARs是靶向目标表面分子的重组受体，其结构主要包括胞外抗原结合域、跨膜区和胞内信号区三部分，对每个区域的不同设计影响CAR-T细胞功能的发挥。
3.2胞外抗原结合域
胞外区源于单链抗体ScFv，由轻链和重链共同组成，负责抗原的识别。这种识别本质上是抗体与抗原的特异性结合，不需要依赖于MHC的递呈，有效避免了肿瘤细胞MHC表达下调这一免疫逃逸机制。CAR不仅能够识别肽类抗原，还能识别糖类和糖脂类抗原，更加广谱地杀伤肿瘤细胞。
目前已设计出的ScFv可识别抗原包括CD19、CD20、EGFR、Her2/neu、GD2、PSMA及RORI等。
3.3跨膜区
跨膜区连接胞内区和胞外区，一般由二聚体膜蛋白组成，将CARs结构锚定于T细胞膜上。
跨膜区的不同设计影响导入的CAR基因的表达能力。有文献证实包含CD28的TM区的CAR表达能力最强，其次是包含OX40的CAR，而包含CD3ζ的CAR表达能力最差。目前设计用于CAR的TM区主要包括H2-Kb、CD4、CD7、CD8、CD28等。
3.4胞内信号域
胞内信号域采用免疫受体酪氨酸活化基序(immune-receptortyrosine-basedactivationmotifs，ITAM)，通常是TCRζ（CD-3ζ）或FcRγ，当胞外区ScFv与其识别的抗原结合时，就会向胞内传导TCＲ样信号。根据胞内区结构不同，可将CAR-T分为四代。
3.5CARs结构变迁
根据胞内区结构不同，CARs结构经历了从第一代到第四代的变迁。
第一代CAR只有一个胞内信号组份，主要是CD-3ζ或FcRγ。当第一代CAR受到特异性抗原识别并激发后，可为T细胞提供活化信号，并通过胞内结构域传导该信号，引起细胞的活化，表现为CAR依赖的细胞活化及细胞杀伤作用，分泌穿孔蛋白、颗粒酶及细胞因子，协同作用杀死肿瘤细胞。早期的实验证明了CAR-T的可行性，是首次不依赖人类白细胞抗原进行T细胞激活的尝试。然而，第一代CAR只能引起短暂地激活T细胞和分泌较低水平的细胞因子，不能提供长时间的T细胞扩增信号和持续的体内抗肿瘤效应。
为了解决这个问题，从第二代CAR开始引入了共刺激分子信号序列（costimulatorymolecule，CM），如CD28、CD（4-1BB）。与第一代CAR相比，第二代CAR含有一个活化结构域和一个共刺激区域，在保持抗原特异性一致的情况下，增强了T细胞增殖和细胞因子分泌的功能。
第三代CAR在前一版本上升级，胞内部分则由活化结构域和多重共刺激区域组成，具有三个胞内信号域，其中包括两个串联的共刺激域CD28、4-1BB或OX40和一个CD-3ζ。这些结构域的增加不仅能够加强CAR-T细胞特异性识别肿瘤抗原及结合等能力，更能够显著扩大由胞外区传递的细胞信号，引起下级细胞杀伤作用的级联放大，抗肿瘤能力更强。
第四代CAR是最近出现的新型CAR，又称TRUCKs(fourth-generationCART-cellsredirectedforuniversalcytokinekilling)。它的结构与前三代不同，引入促炎症细胞因子(如IL-12)和共刺激配体(4-1BBL和CD40L)，可以在具有免疫抑制性的肿瘤微环境中通过释放促炎性因子，招募并活化更多的免疫细胞而引起更为广泛的抗肿瘤免疫效应。同时，第四代CAR的出现可使患者免受回输前预处理治疗（如全身照射或大剂量化疗）的不良反应，减少回输细胞总量，拓宽了CAR-T细胞的临床应用范围。
4.CAR-T的抗体结构
4.1传统抗体
传统抗体是分子量为kDa的四聚体多肽，由两对相同的重链（50kDa）和轻链（25kDa）多肽组成，二者由链间的二硫键链接，形成Y型或T型结构。其中，轻链由N端的可变区（VL）和C端的一个保守的区域(CL)构成；重链由N端的可变区（VH）和三至四个恒定的区域（CH1,CH2,CH3,可能CH4）组成。
可变区的多样性决定了抗体的多样性与特异性，使得抗体具有结合特定抗原的能力。比较不同特异性抗体的VL和VH的氨基酸顺序显示，变异仅集中在其中少数区域的氨基酸上(15％～20％)，称为超变区。超变区是抗体的抗原结合位，与抗原决定簇的结构互补，故又称为互补决定区(
