为探讨放化疗联合树突细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)对结直肠癌的疗效。回顾性分析了51例结直肠癌根治术后行放化疗联合HPS70(HeatShockProtain70)负载的DC-CIK细胞疗法患者的临床资料,采用1∶1配对的方法,以性别、年龄、部位、病理分期、AJCC()中临床分期、术后辅助化疗方案、是否接受术后辅助放疗为指标,在同期行结直肠癌根治术但未行DC-CIK细胞疗法的患者中选择51例作为对照,比较两组患者3年生存率(OS)和3年无病生存率(DFS)。结果显示DC-CIK治疗组及对照组3年生存率分别为88.2%和68.6%,两者比较差异具有显著性(P0.05)。DC-CIK治疗组及对照组3年无病生存率分别为43.1%和27.5%,两者比较差异具有显著性(P0.05)。表明结直肠癌根治术后放化疗联合DC-CIK细胞疗法,能明显提高患者的远期生存率和无病生存率。
全文如下：
1 资料与方法
1.1 研究对象
所选病例为年12月至年10月的住院患者共例,均经病理学、组织学、细胞学等检查确诊为结直肠癌,均行结直肠癌根治术,术后病理检查证实为R0切除。例患者均为AJCC()TMN分期的Ⅰ～Ⅲ期患者,对I期患者,术后不行放化疗。Ⅱ～Ⅲ期患者术后辅助化疗。DC-CIK治疗组51例,男性31例,女性20例,年龄28～86岁,中位年龄59岁,Ⅰ期6例,ⅡA期3例,ⅡB期12例,Ⅲ期30例,术后辅助化疗采用FOLFOX方案33例,采用XELOX方案7例,采用CF+5-Fu方案3例,采用希罗达方案2例。接受术后辅助放疗7例。对照组51例,男性25例,女性26例,年龄20～78岁,中位年龄54岁,其中Ⅰ期6例,ⅡA期3例,ⅡB期12例,Ⅲ期30例,术后采用FOLFOX方案化疗35例,采用XELOX方案3例,采用CF+5-Fu方案5例,采用希罗达方案2例,接受术后辅助放疗9例。两组患者卡氏评分均≥80分,肝、肾功能正常,外周血WBC≥4.0×/L,PLT≥×/L,Hb≥80g/L,无严重的内科疾病。
1.2 主要试剂
Ficoll淋巴分离液(北京军事医学科学院);rhIL24(英国PeproTech公司);TNF2α(上海赛达生物药业有限公司);CD3McAb(武汉生物制品研究所);IFN2r(上海克隆公司);rhIL22(北京瑞德合通药业有限公司);GM-CSF(北京联合药业有限公司);RP2MI、无血清培养基AIM-V(美国Gibco公司)。
1.3 HSP70多肽复合物的制备
来源于患者自身肿瘤组织或肿瘤细胞系经玻璃匀浆或超声波粉碎后,20g/min,离心60min,取上清,参照文献方法,分离纯化HSP70多肽复合物作为肿瘤抗原,用于负载DC。
1.4 方法
参照文献方法新鲜分离的患者抗凝外周全血50ml,经淋巴分离液梯度离心,取界面层单个核细胞,用RPMI培养液悬浮细胞,离心洗涤细胞3次后,收集非贴壁细胞,调整细胞密度约为1×个/ml,加入γ2干扰素0U/ml,24h后加入rhILU/ml,CD3McAb70ng/ml,ILU/ml,每3天换液1次,同时补加rhIL22U/ml。在上述获得的贴壁细胞中加入含GM-CSF0U/ml和rhIL240U/ml的AIMV培养基,每3天换液1次。第3天将按5ng/ml将HSP70多肽复合物加入DC培养液内,第5天加入TNF2α0U/ml,第7天将负载后的DC按1∶5的比例加入CIK培养液中,共培养5～7天。培养10天后制成细胞悬液用输血器回输,隔天回输1次,将DC、CIK两种细胞体外混合后全身输注。剂量:DC-CIK回输ml/瓶,细胞数≥10的8次方个/ml,连续8次为1个疗程。治疗组患者最少行1个疗程的DC-CIK治疗,最多行6个疗程的DC-CIK治疗,平均行4个疗程的DC-CIK治疗,给药时间一般在术后或化疗结束后15天开始。
1.5 化疗及放疗方案
所有Ⅱ～Ⅲ期患者行术后辅助化疗,采用FOLFOX、XELOX、CF+5-Fu或希罗达方案化疗4～10个周期。术后对Ⅱ～Ⅲ期部分直肠癌患者辅助放疗,术后4～6个周开始放疗,照射剂量为每周第1～5天,每天2Gy,共5周,总照射剂量为50Gy。结肠癌患者未辅助放疗。
1.6 疗效评价
以复发时间和生存期作为观察指标,观察时间为患者手术时间到年10月1日。
1.7 统计学方法
采用SPSS15.0软件包进行生存率、无病生存率计算。应用Kap-lan-Meier生存曲线和Logranktest检验比较两组生存率及无病生存率。率检验采用χ2检验,以P0.05表示统计学差异显著。
2 结果
2.1 DC-CIK治疗组与对照组临床资料对比结果两组从性别、年龄、病理分期、AJCC()中临床分期、术后辅助化疗方案、肿瘤部位和是否接受术后辅助放疗等方面进行比较,经卡方检验,结果显示两组资料无统计学差异,具有可比性(P0.05)。
2.2 生存率
全部病例随访至年10月,随访时间为13～62个月,无失访,随访率为.0%。DC-CIK治疗组1、2、3年生存率分别为.0%、92.2%、88.2%,对照组1、2、3年生存率分别为.0%、86.3%和68.6%。DC-CIK治疗组和对照组中位生存期(mOS)分别为63个月(95%CI,)、52个月(95%CI,)。Kap-lan-Meier生存曲线和Logranktest检验结果表明,治疗组生存期明显长于对照组(P0.05)。
2.3 无病生存率分析
全部病例随访至年10月,随访时间为1～62个月,无失访,随访率为.0%。DC-CIK治疗组1、2、3年无病生存率(DFS)分别为80.4%、54.9%、43.1%,对照组1、2、3年无病生存率(DFS)分别为54.9%、33.3%和27.5%。治疗组和对照组中位无病生存时间(mDFS)分别为34个月(95%CI,)、25个月(95%CI,)。Kap-lan-Meier生存曲线和Logranktest检验结果表明治疗组无病生存率明显高于对照组(P0.05)
3 讨论
DC-CIK细胞具有增殖快、杀伤活性强等优点,在结直肠癌的治疗中具有广阔应用前景。细胞因子诱导的杀伤细胞CIK细胞(cytokineinducedkillercells)是1种新型免疫活性细胞,兼有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和自然杀伤(naturalkillercell,NK)细胞的非主要组织相关性复合物限制性杀瘤的特点,杀伤活性可达84.7%。树突细胞(dendriticcell,DC)是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞,可有效激发T细胞应答,有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制。但肿瘤抗原肽的分子量均较小,难以直接被DC所摄取;即使被DC摄取,亦不能有效的促进DC成熟并表达各种黏附分子,缺乏激活T细胞的第二信号,难以形成有效的免疫应答。HSP的中文全称是“热休克蛋白”,可与小分子肿瘤抗原肽结合,增强其免疫原性。肿瘤细
胞中HSPs结合有大量肿瘤细胞特异性抗原,因其携带几乎所有肿瘤抗原,故从肿瘤细胞中获取HSP70多肽复合物,既可得到该肿瘤细胞高效、强免疫原性的肿瘤抗原,同时,由于HSPs为高度保守蛋白质,同种内不具多态性,可实现对同一肿瘤内的所有瘤细胞特异杀伤,克服了肿瘤免疫治疗中难解决的抗原多变性及细胞异质性的问题。DC与经纯化的肿瘤HSP70多肽复合物结合负载后,可活化机体特异性免疫和非特异性免疫反应,诱导机体产生长寿(long-lasting)的抗肿瘤免疫效应。张嵩等以白血病细胞系NB4建立裸鼠模型,结果发现在培养的15d,DC-CIK细胞较CIK细胞增殖率明显提高,并可明显抑制肿瘤的成瘤率,予BAUl/c裸鼠经尾静脉注射LoVo结肠癌细胞建立转移性肺癌模型.并以DC-CIK细胞进行免疫治疗,结果发现DC-CIK细胞较CIK细胞有更强的杀瘤活性.可有效抑制血源性肿瘤转移,延长荷瘤鼠的生存时间。张京雨等报道化疗联合CIK细胞回输的结直肠癌患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK均显著高于化疗前组,且CD8+显著低于对照组,说明化疗后及时应用CIK细胞回输可显著改善结直肠癌的免疫功能,有助于提高机体的抗肿瘤免疫效应。
本研究采用了HPS70负载的DC-CIK,明显提高了肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL),诱导高效的抗肿瘤免疫效应,结果显示DC-CIK治疗组3年生存率及3年无病生存率明显高于对照组,因此结直肠根治术后放化疗联合应用HPS70负载的DC-CIK是安全有效的,结直肠癌根治术后放化疗联合DC-CIK细胞疗法能明显减低复发率,并很有可能对提高结直肠癌患者的远期生存率有帮助。
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