WINTER
今天跟大家分享一篇通过基因治疗手段来解决线粒体缺陷所导致的亚急性坏死性脑脊髓病(Leighsyndrome)。
Leighsyndrome是一种与线粒体缺陷有关的神经退行性疾病，是常染色体阴性遗传病，在活产儿中的发病率为1/。该病以脑损伤，运动能力和肌张力的逐渐丧失，发育迟缓为特征。并发症可导致心脏，呼吸和肾脏功能损伤。上睑下垂，眼肌麻痹，视力减退或消失，视野有中心暗点，瞳孔散大或缩小。疾病症状在出生后第一年出现，并在两到三年内导致死亡。成人发生LS的报道并不多见。血乳酸和丙酮升高。
目前国内外研究证实,线粒体呼吸链5种酶复合物(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ)缺陷、丙酮酸脱氢酶复合物缺陷以及线粒体转运RNA突变等均可引起Leigh综合征。几乎1/3的LS疾病与复合物I缺乏相关。NADHdehydrogenase(ubiquinone)Fe-sulfurprotein4(NDUFS4)，NADH脱氢酶(泛醌)铁硫蛋白4是组成线粒体氧化呼吸链中的复合物Ⅰ的关键。故在研究由线粒体复合物I缺陷所导致的Leighsyndrome时，通常采用Ndufs4基因敲除的小鼠模型。
本研究选用四周大的Ndufs4KO鼠，通过眶后注射的方式，递送1×genomecopies的病毒液。本研究选用了具有穿透血脑屏障的AAV-PHP.B血清型，实验分为三组：WT+AAV-PHP.B-CBA-GFP,Ndufs4_KO+AAV-PHP.B-CBAGFP,Ndufs4_KO+AAV-PHP.B-CBA-Ndufs4。
Ndufs4KO小鼠在包括大脑、视网膜、肝脏和心脏在内的几个器官出现严重病理。他们首先验证了AAV.PHP.B载体在1个月大的小鼠静脉注射后转导这些组织是有效的。注射AAV-GFP两周后，可以在整个中枢神经系统检测到转基因表达(补充图1A)。在嗅球、纹状体、海马、黑质、小脑、脊髓和前庭核中观察到gfp阳性细胞，并与普遍存在的特异性的神经标记物共定位(补充图1B和C)。载体在肝脏、心脏、肌肉和视网膜等组织中也能有效诱导转基因表达(补充图1C和D)。
SupplementaryFig1:SystemicdeliveryoftheAAV-PHP.B-Ndufs4vectorinduceswidespreadexpressionofthetransgeneintheCNSandperipheralorgans.
使用GFP载体的KO小鼠死亡的平均年龄为54天。相比之下，基因替代疗法显著延长了Leigh综合征小鼠的寿命，50%使用AAV-Ndufs4载体的KO小鼠存活了天。每两周对动物体重的监测显示，Ndufs4基因的传递改善了这一参数，促进了KO小鼠的体重增长。在死亡之前，Ndufs4KO小鼠的体温逐渐降到34度以下，基因替代疗法挽救了低温症状，AAVNdufs4载体治疗的KO动物维持了与对照组小鼠相似的核心体温。WB证实这些生理改善与Ndufs4在大脑、肝脏、心脏的表达恢复有关，与Ndufs4表达恢复一致的是，BN-PAGE和总OxPhos免疫染色显示线粒体复合物I活性的改善。
Figure1:GenereplacementtherapyinNdufs4KOmiceextendslifespanbyrestoringmitochondrialfunction.
由于Leigh综合征主要影响大脑并在患者中引起严重的神经系统症状，他们首先评估了小鼠抱爪表型。抓住尾巴使小鼠悬吊起来，进行30秒的检查。在经过AAV-GFP处理的KO小鼠中，有75%的小鼠在45天大时表现出蜷爪行为，而在AAV-Ndufs4处理组中，只有13%的小鼠表现出这种表型(图2A)。值得注意的是，使用AAV-Ndufs4载体的KO小鼠在天大时没有表现出这种表型特征。
小鼠被放置在2升的玻璃缸体中，录像5分钟，并将静止时间作为运动的指标进行测量。与AAV-GFP处理的KO小鼠相比，AAV-Ndufs4处理组的运动活动得到了长期持续的改善，表现为不活动的时间减少和较多的探索行为。
小鼠被放置在一个标准的铁丝笼盖上。轻轻摇动盖子，让小鼠抓住铁丝，然后倒挂在一个装有筑巢材料的开放式笼子上，悬吊在40厘米高的地方，以防受伤。在3min内统计小鼠坚持了多长时间才掉落。AAV-Ndufs4处理组的小鼠在悬挂试验中也观察到力量的长期改善。
检测三小时内癫痫发作的情况。用表达gfp的病毒载体治疗的约23%的KO小鼠也出现了癫痫发作,注射AAV-Ndufs4载体的KO小鼠中，只有5%诱发癫痫发作。
Figure2:Ndufs4genetherapyamelioratesbehaviouralperformances
小胶质细胞做为脑内免疫细胞，在脑病变或者损伤时快速感测神经障碍并被活化。活化的小胶质细胞在数量与形态上有显著的变化并迁移到损伤部位，发挥多种功能，例如吞噬死细胞、促炎性细胞因子产量增加等，因此认为其参与了各种中枢神经系统疾病。Iba1抗体已被广泛用作小胶质细胞标记物。
星形胶质细胞涉及多种中枢神经系统疾病，包括创伤、缺血和神经退行性变。在多种疾病中，GFAPmRNA和蛋白水平升高。星形胶质细胞在大脑中含量丰富，是大脑中最丰富的细胞类型，为神经元(包括神经递质谷氨酸循环和营养因子释放)提供结构和功能支持，在神经生理活动、神经组织再生及免疫、多种神经疾病的发病中发挥重要作用。GFAP基因的初始激活标志着星形胶质细胞的分化，而它的上调通常伴随着对中枢神经系统损伤的反应性反应。
嗅球，小脑和前庭核小胶质细胞的组织学分析(Iba1)和星形胶质细胞(GFAP)标记,显示AAV-mediated基因疗法预防这种炎症反应的发展；与此同时，使用AAVNdufs4载体的小鼠嗅球在45天和天时，由神经元代谢窘迫引起的胶质细胞脂质积累明显减少；为了评估基因替代对神经退行性变的影响，我们量化了小脑calbindin阳性浦肯野细胞的数量，发现AAV-Ndufs4载体在45天和天的KO小鼠中拯救了大量这些神经元。浦肯野细胞（Purkinjecell）是从小脑皮质发出的唯一能够传出冲动的神经元。浦肯野细胞在运动协调中起着重要的作用。
Figure3:RestorationofNUFS4expressioninthebrainpreventedneuronalandglialpathology.
在利氏综合征小鼠模型中，除了大脑，视网膜也受到严重影响，Ndufs4表达的恢复与b波反应的维持有关，而在KO+AAV-PHP.B-CBA-GFP小鼠中，b波反应是缺失的，递送了Ndufs4的KO小鼠中存在B波，即使与对照组相比振幅有显著性下降，他们发现，与KO+GFP组相比，在Ndufs4KO小鼠中注射AAV-Ndufs4载体可以保护视网膜神经节细胞。
Figure4:Correctionofretinalpathologyandfunction
除了上述病理外，Ndufs4KO小鼠还表现出代谢紊乱等症状。Ndufs4KO递送GFP组小鼠的血细胞比容增加，（血细胞比容是血细胞在全血中所占的容积百分比）红细胞比容增多。见于各种原因所致的血液浓缩，如大量呕吐、腹泻、失水、大面积烧伤、真性红细胞增多症、甲状腺功能亢进(轻度)；慢性充血性心力衰竭、先天性或后天性心脏病在缺氧时可致红细胞比容增加；递送GFP的Ndufs4KO小鼠血乳酸水平降低；已经证明Ndufs4基因的缺失会导致肥厚性心肌病,并且血细胞比容的增加也与心脏异常相关，所以接下来作者又进行了心脏的组织形态学检测。递送GFP的Ndufs4KO小鼠心肌肥厚，心室腔变小，而表达ndufs4的载体在解剖和细胞水平上纠正了心脏的这种异常。
SupplementaryFig3:Ndufs4genereplacementrescuedthecardiacpathology
小编总结：
本篇文章首次报道了利氏病通过基因治疗手段可以得到长期受益的一个结果。文中检测的指标比较全面，包括神经、行为、视网膜、心脏、代谢等等……但是都是单剂量实验，若有多组剂量，会更有研究意义，而且监测指标虽然全面，但研究层次均不深，属表层探讨。
参考文献：
RobinReynaudDulaurier,GiorgiaBenegiamo,ElenaMarrocco,etal.GenereplacementtherapyprovidesbenefitinanadultmousemodelofLeighsyndrome,BRAIN:;–
责编：张静文
（中国科学院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室研究生）
排版：杨宁
（中国科学院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室研究生）
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